乳腺癌细胞中miR-339-5p对BCL-6表达的调节 被引量：6

1

作者 刘雪 吴正升 吴强 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期244-246,共3页

目的预测和验证miR-339-5p下游直接靶基因。方法利用生物信息学方法预测miR-339-5p潜在靶基因;克隆目标基因3’UTR,将其与含荧光素酶报告基因的质粒psiCHECK-2连接后,与miR-339-5p mimics共转染乳腺癌细胞株T47D,做荧光素酶报告实验验证... 目的预测和验证miR-339-5p下游直接靶基因。方法利用生物信息学方法预测miR-339-5p潜在靶基因;克隆目标基因3’UTR,将其与含荧光素酶报告基因的质粒psiCHECK-2连接后,与miR-339-5p mimics共转染乳腺癌细胞株T47D,做荧光素酶报告实验验证miR-339-5p靶基因;人乳腺癌细胞株T47D转染miR-339-5p mimics(模拟物)后,行Western blot法检测靶基因蛋白表达。结果生物信息学方法预测结果显示BCL-6为miR-339-5p潜在靶基因之一;荧光素酶报告实验显示,miR-339-5p可直接调节BCL-6基因3’UTR;Western blot法检测结果显示T47D细胞转染miR-339-5p mimics后,BCL-6蛋白表达水平明显下调。结论 miR-339-5p可以调节下游靶基因BCL-6的表达。 展开更多

关键词 MIRNA miR-339-5p BCL-6 荧光素酶报告实验

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miR-196a靶向调控HOXA9基因的实验研究 被引量：2

2

作者 窦立萍 李永辉 +1 位作者 王莉莉 于力 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期166-169,共4页

目的:研究HOXA9基因的表观遗传学调控机制,筛选靶向调控HOXA9基因的microRNA。方法:利用Tar-getscan在线分析软件预测特异性靶向HOXA9基因3'端非编码区域(3’UTR)的microRNA,采用PCR方法从1例健康供者DNA中扩增HOXA9基因3’UTR序列... 目的:研究HOXA9基因的表观遗传学调控机制,筛选靶向调控HOXA9基因的microRNA。方法:利用Tar-getscan在线分析软件预测特异性靶向HOXA9基因3'端非编码区域(3’UTR)的microRNA,采用PCR方法从1例健康供者DNA中扩增HOXA9基因3’UTR序列,插入经XbaI和PstI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-M,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶重组质粒及microRNA表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。构建miR-196a结合位点突变的HOXA9基因3’端非编码区域突变型荧光素酶报告载体,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶突变型重组质粒及miR-196a表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。miR-196amimics以脂质体Hiperfect转染至MV4-11细胞,实时定量PCR及Westernblot检测HOXA9mRNA及蛋白的表达。结果:成功构建了含有1628bp的HOXA9基因3’UTR序列的荧光素酶报告重组质粒pGL3-HOXA9-3’UTR,并通过酶切及基因测序方法的鉴定;荧光素酶报告实验提示miR-196a组荧光素酶活性明显低于对照组。成功构建了miR-196a的2个结合位点突变的HOXA9基因3’UTR序列的突变型荧光素酶报告重组质粒pGL3-HOXA9-mut3’UTR,并通过基因测序方法的鉴定。miR-196a可以下调野生型质粒的荧光素酶活性,不影响突变型质粒的荧光素酶活性。MV4-11细胞中过表达miR-196a,可以明显下调HOXA9mRNA及蛋白表达。结论:miR-196a通过靶向结合HOXA9基因3’UTR的结合位点特异调控HOXA9基因。 展开更多

关键词 MICRORNA 白血病 HOXA9基因 荧光素酶报告实验

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MiR-26a和异黏蛋白的关系及在裸鼠体内荷瘤实验的验证

3

作者 杨晨晨 范宇琴 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期82-91,共10页

目的探讨miR-26a和异黏蛋白(MTDH)的关系。方法采用免疫组织化学SP染色法检测86例食管癌病理组织芯片中MTDH的表达,采用原位杂交检测miR-26a的表达,分析两者表达的相关性。通过生物信息学预测软件Targetscan Human7.2预测MTDH在miR-26a... 目的探讨miR-26a和异黏蛋白(MTDH)的关系。方法采用免疫组织化学SP染色法检测86例食管癌病理组织芯片中MTDH的表达,采用原位杂交检测miR-26a的表达,分析两者表达的相关性。通过生物信息学预测软件Targetscan Human7.2预测MTDH在miR-26a序列上的结合片段。采用荧光素酶报告实验验证MTDH与miR-26a的靶向调控关系。用慢病毒干扰和过表达的食管癌细胞系进行裸鼠皮下注射,观察瘤块的形成,采用免疫组织化学染色法和原位杂交法检测各组瘤体中MTDH和miR-26a的表达,分析其关系。结果MiR-26a在食管癌组织中的表达明显低于配对癌旁正常食管组织,而MTDH在食管癌组织中的表达明显高于配对癌旁正常食管组织。MiR-26a的表达与患者病理分级(P<0.05)、N分期(P<0.05)、肿瘤体积(P<0.01)有关。MTDH在食管癌中的表达与N分期(P<0.05)、分化程度(P<0.01)有关。采用Targetscan Human7.2生物信息学软件预测发现,MTDH基因中含有1个hsa-miR-26a的靶序列。荧光素酶报告基因实验也证实了miR-26a与MTDH的靶向调控关系。MiR-26a在KYSE-450细胞中表达最高,在Eca109细胞中表达量最低,本研究采用KYSE-450细胞系进行miR-26a干扰实验的裸鼠实验,采用Eca109细胞系进行过表达实验。过表达miR-26a慢病毒转染的细胞注射裸鼠皮下,成瘤后miR-26a的表达升高,MTDH的表达降低。干扰miR-26a慢病毒转染的细胞注射裸鼠皮下,成瘤后瘤块中miR-26a的表达降低,MTDH表达升高。结论MiR-26a能抑制食管癌细胞MTDH表达,在体外和体内实验,均可验证miR-26a与MTDH的靶向调控关系,miR-26a可能通过MTDH通路在食管癌的发生和发展中扮演着癌基因的角色。 展开更多

关键词 微小RNA-26a 异黏蛋白 移植瘤 食管癌 免疫组织化学SP染色法 原位杂交 荧光素酶报告实验 裸鼠

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HMGB2启动子报告基因载体的构建、活性验证及与其结合的转录因子的预测

4

作者 王飞 冯奇 +2 位作者 秦杰 李婉 卢春 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2018年第3期195-199,204,共6页

目的:构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法:在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动... 目的:构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法:在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动子序列片段,将其克隆至pGL3-Basic载体中,构建重组质粒pGL3-HMGB2-promoter,并通过双酶切和测定核酸序列鉴定。采用虫荧光素酶报告实验验证pGL3-HMGB2-promoter重组质粒的活性,进一步通过在线软件PROMO预测可以与HMGB2启动子序列结合的转录因子。结果:经限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对,证实pGL3-HMGB2-promoter重组质粒构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,构建的重组质粒具有启动子活性。PROMO在线软件分析结果表明,有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合。结论:成功构建了含有HMGB2启动子序列的荧光素酶报告基因重组质粒,该质粒具有启动子活性,且有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合,促进HMGB2的转录。 展开更多

关键词 高迁移率族蛋白B2 启动子 虫荧光素酶报告实验 转录因子

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快速分离和鉴别转基因单克隆细胞的改良方法

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作者 王亚婷 李新娜 +9 位作者 张丽娜 郭芳 杜鹃 赵溶冰 张正银 周晓娜 汪晶冰 李剑华 刘敏 方宏罡 《中国优生与遗传杂志》 2016年第4期36-39,F0003,共5页

目的探索快速有效的从稳定转染后的悬浮多克隆细胞中分离、纯化并鉴定出单克隆的技术改良法。方法电穿孔法稳定转染后的T淋巴细胞系先在分离培养基中扩增成多克隆,用有限稀释法分离出单个细胞,一部分用丝裂霉素C处理的饲养细胞培养扩增... 目的探索快速有效的从稳定转染后的悬浮多克隆细胞中分离、纯化并鉴定出单克隆的技术改良法。方法电穿孔法稳定转染后的T淋巴细胞系先在分离培养基中扩增成多克隆,用有限稀释法分离出单个细胞,一部分用丝裂霉素C处理的饲养细胞培养扩增单克隆,一部分进行无饲养细胞扩增,用未转染的T淋巴细胞系的新鲜培养上清换液,对比两法的单克隆得率。检测单克隆的靶基因整合则先用荧光素酶报告实验再结合引物PCR扩增法,筛选出表达标记蛋白并整合有完整特异基因片段的单克隆。结果两种方法在分离培养基中存活增殖的活细胞克隆数量比例分别为5.27%和4.55%,无显著差异,通过荧光素酶报告基因实验确定完整整合外源基因的靶克隆比率(0.80%和0.57%)也无显著差异。单克隆的报告荧光素酶表达强度显著高于多克隆和对照,比较直观快速。结论无饲养细胞法避免了饲养细胞复燃污染单克隆细胞,简化了步骤提高了效率,能保证单个细胞在选择培养基中成功扩增出单克隆。荧光素酶报告基因实验能快速、有效检测出外源整合基因的表达。 展开更多

关键词 饲养细胞 单克隆 培养上清 荧光素酶报告实验 丝裂霉素C

原文传递

microRNA调控NK细胞KIR3DL1表达初探

6

作者 李晓红 吴晓雄 +4 位作者 达万明 李猛 蔡博 于力 高春记 《军医进修学院学报》 CAS 2011年第5期483-485,503,共4页

目的初步探寻人外周血自然杀伤细胞(Nature Killer,NK)杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Cell Immnoglobulin-Like Receptor,KIR3DL1)表达可能存在的microRNA(miR)调控机制。方法利用生物信息学方法,从miR信息库中筛选出可能与KIR3DL1... 目的初步探寻人外周血自然杀伤细胞(Nature Killer,NK)杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Cell Immnoglobulin-Like Receptor,KIR3DL1)表达可能存在的microRNA(miR)调控机制。方法利用生物信息学方法,从miR信息库中筛选出可能与KIR3DL1相关的miRs,构建含KIR3DL1 3’非翻译区(UTR)的PGL3质粒,分别将含相应miR的PcDNA3.0质粒与前者共转染293T细胞,通过荧光素酶报告实验及之后的突变实验筛选出可能调控KIR3DL1的miR。结果通过TARGET SCAN信息库筛选了miR-146b等10个miR;转染miR-146b后,荧光素酶活性下降最多(61.3%),突变其KIR3DL1 3’UTR靶位点后荧光素酶活性恢复(91.4%)。结论 miR-146b可与KIR3DL1’UTR在靶位点特异结合,很可能参与KIR3DL1表达的调控。 展开更多

关键词 MICRORNA 自然杀伤细胞 杀伤细胞免疫球蛋白样受体 荧光素酶报告实验

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长链非编码RNA6030408B16RIK结合微小RNA-326-3p参与腹膜透析超滤衰竭发生的机制 被引量：1

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作者 李欣绪 周忠启 +3 位作者 王志奎 张磊 孙丽娜 蔄瑜林 《安徽医药》 CAS 2023年第2期265-270,共6页

目的研究长链非编码RNA6030408B16RIK(LncRNA6030408B16RIK)结合微小RNA(miRNA-326-3p)致大鼠尿毒症模型腹膜纤维化的机制,为预防超滤衰竭提供新的依据。方法将36只造模成功的尿毒症大鼠分为六组,每组6只大鼠,分别为:尿毒症组(不行腹膜... 目的研究长链非编码RNA6030408B16RIK(LncRNA6030408B16RIK)结合微小RNA(miRNA-326-3p)致大鼠尿毒症模型腹膜纤维化的机制,为预防超滤衰竭提供新的依据。方法将36只造模成功的尿毒症大鼠分为六组,每组6只大鼠,分别为:尿毒症组(不行腹膜透析治疗),空白组(腹膜透析4周),NC组(腹膜透析4周+转染空质粒),inhibitor NC组(腹膜透析4周+转染空质粒抑制剂),miR-326-3p mimic组(腹膜透析4周+miR-326-3p模拟物),miR-326-3p inhibitor组(腹膜透析4周+miR-326-3p抑制剂)。构建LncRNA6030408B16RIK原始序列载体及LncRNA6030408B16RIK突变体载体,将miR-326-3p模拟物及模拟物阴性对照(mimic NC)分别与荧光素酶报告载体共同转入HEK-293T细胞中;以双荧光素酶报告实验、RNA pull down实验验证LncRNA6030408B16RIK与miR-326-3p的靶向关系,用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)分析包括α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP1)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)等在内的多种腹膜纤维化相关因子的表达情况。结果双荧光素酶实验结果:pWt-LncRNA6030408B16RIK(野生型LncRNA6030408B16RIK)的荧光素酶活性[(0.49±0.05)比(1.01±0.11)]明显降低(P<0.05),而pMut-LncRNA6030408B16RIK(突变型LncRNA6030408B16RIK)的荧光素酶活性[(1.00±0.10)比(1.03±0.12)]没有明显变化(P>0.05)。与尿毒症组相比,miR-326-3p mimic组中α-SMA、FSP1、波形蛋白表达量[(0.51±0.06)、(0.22±0.03)、(0.61±0.06)比(0.81±0.09)、(0.62±0.08)、(0.96±0.10)]明显下降,E-钙黏蛋白[(1.99±0.21)比(1.14±0.14)]明显上升(P<0.05),而与空白组相比,miR-326-3p inhibitor组中α-SMA、FSP1、波形蛋白表达[(1.57±0.16)、(1.16±0.18)、(1.72±0.17)比(0.92±0.09)、(0.64±0.07)、(0.92±0.10)]明显上升,E-钙黏蛋白表达[(0.62±0.06)比(1.14±0.15)]明显下降(P<0.05)。结论LncRNA6030408B16RIK可直接结合miR-326-3p,而过表达miR-326-3p可抑制尿毒 展开更多

关键词 腹膜纤维化 尿毒症 超滤 腹膜透析 microRNA-326-3p 双荧光素酶报告实验

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稳定过表达mir-101结直肠癌细胞株的建立及其靶基因的鉴定 被引量：5

8

作者 刘燕 陆滟霞 +2 位作者 周敏 张超 李学农 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期928-933,共6页

目的构建稳定过表达mir-101的SW620细胞亚株并鉴定mir-101的靶基因。方法运用荧光定量PCR技术检测结直肠癌细胞株中mir-101的表达水平。利用GV209-mir101慢病毒感染SW620细胞,建立稳定过表达mir-101的细胞株。扩增包含mir-101结合位点的... 目的构建稳定过表达mir-101的SW620细胞亚株并鉴定mir-101的靶基因。方法运用荧光定量PCR技术检测结直肠癌细胞株中mir-101的表达水平。利用GV209-mir101慢病毒感染SW620细胞,建立稳定过表达mir-101的细胞株。扩增包含mir-101结合位点的RAC1 3'UTR基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-Rac1-Mut;并用双萤光素酶报告实验检测RAC1 3'UTR相对荧光素酶活性。结果稳定过表达mir-101的细胞株中,mir-101的表达明显高于对照组。双萤光素酶报告实验证实mir-101 inhibitors可以上调3'UTR相对荧光素酶活性。稳定过表达mir-101,RAC1表达下调;而干扰mir-101之后RAC1表达上调。结论成功构建稳定过表达mir-101的SW620细胞亚株。RAC1是mir-101的靶基因。 展开更多

关键词 结直肠癌 mir-101 慢病毒 双荧光素酶报告实验 RAC1

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长链非编码RNA NCK1-AS1作为海绵体与TCF4竞争结合miR-153-5p调节乳腺癌细胞侵袭、炎症和凋亡

9

作者 杨婵婵 杨文辉 +3 位作者 张文涛 乔龙飞 佘明豪 赵亚鹏 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期777-782,共6页

目的:研究LncRNA NCK1-AS1与miR-153-5p调节转录因子4(TCF4)对乳腺癌细胞生长、运动和炎症因子的影响。方法:以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7作为体外研究对象,将裸鼠作为体内研究对象。RT-qPCR检测组织和细胞中LncRNA NCK1-AS1、miR-153... 目的:研究LncRNA NCK1-AS1与miR-153-5p调节转录因子4(TCF4)对乳腺癌细胞生长、运动和炎症因子的影响。方法:以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7作为体外研究对象,将裸鼠作为体内研究对象。RT-qPCR检测组织和细胞中LncRNA NCK1-AS1、miR-153-5p和TCF4表达;TargetScan预测与双荧光素酶报告实验验证LncRNA NCK1-AS1与miR-153-5p的靶向关系;Transwell检测细胞侵袭;ELISA检测炎症因子水平;流式细胞术检测凋亡;Western blot检测TCF4、c-myc、c-jun蛋白水平;裸鼠皮下注射MDA-MB-231细胞建立移植瘤模型;免疫组化检测Caspase-3、VEGF阳性细胞百分比。结果:LncRNA NCK1及TCF4在癌组织和细胞中高表达,而miR-153-5p则低表达。与对照组比较,LncRNA NCK1-AS1干扰抑制乳腺癌细胞侵袭和炎症反应,并促进其凋亡。LncRNA NCK1-AS1与miR-153-5p存在靶向关系。与对照组相比,LncRNA NCK1-AS1干扰和miR-153-5p过表达降低了细胞TCF4、c-myc和c-jun表达,而TCF4转染上调TCF4、c-myc和c-jun表达。与sh-NC组比较,shNCK1-AS1组裸鼠肿瘤体积、重量降低,NCK1-AS1表达降低,miR-153-3p表达升高,Caspase-3阳性细胞百分比升高,VEGF阳性细胞百分比降低,TCF4、c-myc和c-jun蛋白表达降低。结论:LncRNA NCK1-AS1和miR-153-3p通过TCF4调节乳腺癌细胞侵袭、炎症和凋亡。 展开更多

关键词 LncRNA NCK1-AS1 TCF4 免疫组化 双荧光素酶报告实验 乳腺癌

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Let-7a-5p靶向整合素αV调节气道平滑肌细胞转化生长因子β1表达和活化

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作者 闻康 郭佳 +3 位作者 倪凯 杨崇鑫 罗明志 邓林红 《生物医学工程研究》 2022年第2期122-128,共7页

为探究微小RNA(microRNA,miRNA)let-7a-5p对气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)转化生长因子β1(transformation growth factorβ1,TGFβ1)表达和活化的影响,本研究使用生物信息学方法预测let-7a-5p靶基因,构建含靶基因3... 为探究微小RNA(microRNA,miRNA)let-7a-5p对气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)转化生长因子β1(transformation growth factorβ1,TGFβ1)表达和活化的影响,本研究使用生物信息学方法预测let-7a-5p靶基因,构建含靶基因3′-UTR段的双荧光素酶报告载体,验证其活性;随后采用let-7a-5p模拟物和抑制剂分别增加和降低ASMCs胞内let-7a-5p表达,检测TGFβ1的表达以及分泌。预测显示,let-7a-5p靶向整合素αV(integrinαV,ITGAV)基因3′-UTR。构建含ITGAV基因3′-UTR序列双荧光素酶报告质粒、凝胶电泳和基因测序。结果表明,质粒重组成功。Let-7a-5p模拟物显著降低荧光素酶活性和ITGAV基因mRNA表达,提示let-7a-5p靶向ITGAV基因3′-UTR。Let-7a-5p模拟物显著降低ASMCs胞内TGFβ1的mRNA表达,但增加胞外TGFβ1含量。Let-7a-5p通过靶向ITGAV基因降低ASMCs胞内TGFβ1表达,但促进胞外TGFβ1活化,提示let-7a-5p可能通过靶向ITGAV促进TGFβ1活化参与气道结构和功能的调控。 展开更多

关键词 微小RNA 气道炎症 气道细胞 炎症因子 整合素信号 双荧光素酶报告实验

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miR-200a-3p通过靶向MMP-1抑制膀胱癌T24细胞侵袭及转移 被引量：1

11

作者 梁冰 罗后宙 《药物生物技术》 2021年第3期257-260,共4页

探讨miR-200a-3p靶向调控MMP-1对膀胱癌T24细胞迁移和侵袭能力的影响。运用Target Scan Human 7.2生物信息学软件预测miR-200a-3p的下游靶基因,采用双荧光素酶报告实验验证MMP-1为miR-200a-3p的下游靶基因。在T24细胞中转染miR-200a-3p ... 探讨miR-200a-3p靶向调控MMP-1对膀胱癌T24细胞迁移和侵袭能力的影响。运用Target Scan Human 7.2生物信息学软件预测miR-200a-3p的下游靶基因,采用双荧光素酶报告实验验证MMP-1为miR-200a-3p的下游靶基因。在T24细胞中转染miR-200a-3p mimics或miR-200a-3p inhibitor后,采用实时荧光定量PCR技术检测MMP-1 mRNA的表达量、Western blotting检测MMP-1蛋白的表达量。通过Transwell小室法检测T24细胞的迁移和侵袭能力。miR-200a-3p靶向调控MMP-1的3’-UTR,降低了荧光素酶的表达活性。与对照组比,miR-200a-3p mimics组MMP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低,且miR-miR-200a-3p mimics组细胞的迁移、侵袭能力也均降低。与对照组比,miR-200a-3p inhibitor组MMP-1 mRNA和蛋白表达水平明显升高,且miR-200a-3p inhibitor组细胞的迁移、侵袭能力也均升高。miR-200a-3p通过靶向调控MMP-1抑制膀胱癌T24细胞侵袭及转移。 展开更多

关键词 miR-200a-3p 基质金属蛋白酶1 膀胱癌 迁移 侵袭 双荧光素酶报告实验

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谱效捕获技术筛选蛇胆陈皮口服液抗炎平喘药效成分 被引量：7

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作者 虞涛 万丹 +2 位作者 张瑶纾 姜民 董林毅 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期459-463,共5页

目的建立超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱与(NF-κB和β2-肾上腺素能受体)双荧光素酶报告基因检测系统相结合的方法,快速测定蛇胆陈皮口服液中抗炎平喘活性成分。方法利用NF-κB和β2-肾上腺素能受体活性的双荧光素酶报告基因检测系... 目的建立超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱与(NF-κB和β2-肾上腺素能受体)双荧光素酶报告基因检测系统相结合的方法,快速测定蛇胆陈皮口服液中抗炎平喘活性成分。方法利用NF-κB和β2-肾上腺素能受体活性的双荧光素酶报告基因检测系统,筛选潜在的抗炎解痉成分,同时根据四级杆飞行时间质谱数据对筛选结构进行鉴定。结果蛇胆陈皮口服液中辛弗林抑制β2-AR激活效应最明显;胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸抑制NF-κB激活作用最显著。结论双活性评价谱效捕获方法是对筛选中药复方的有效成分的一种快速有力的手段。 展开更多

关键词 液质联用 Β2受体激动剂 抗炎 平喘 双荧光素酶报告基因实验

原文传递

miR-515对凝集素-2的调控作用以及宫内膜间质细胞生物学行为的影响

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作者 葛维媛 晋晓丽 于力 《中国妇产科临床杂志》 CSCD 北大核心 2024年第1期58-62,共5页

目的探讨微小RNA-515(micro RNA-515,miR-515)对凝集素2(Intelectin 2,ITLN2)的调控作用以及对子宫内膜间质细胞(endometrial stroma cells,ESCs)生物学行为的影响。方法 分离ESCs细胞并进行传代培养,分为对照组(转染NC)、过表达组(转染... 目的探讨微小RNA-515(micro RNA-515,miR-515)对凝集素2(Intelectin 2,ITLN2)的调控作用以及对子宫内膜间质细胞(endometrial stroma cells,ESCs)生物学行为的影响。方法 分离ESCs细胞并进行传代培养,分为对照组(转染NC)、过表达组(转染miR-155 mimics)、抑制组(转染miR-515inhibitor)和逆转组(转染miR-515mimics+pcDNA-ITLN2),检测各组ESCs增殖、凋亡、侵袭和转移情况,以及RNA和蛋白的表达。结果 过表达组细胞增殖、迁移细胞个数和侵袭细胞个数显著升高、凋亡率显著下降(P <0.05);抑制组细胞增殖、迁移细胞个数和侵袭细胞个数值显著下降,凋亡率显著上升(P <0.05)。过表达组miR-515表达显著升高,ITLN2 mRNA和ITLN2蛋白表达显著下降(P <0.05);抑制组miR-515表达显著下降,ITLN2mRNA和ITLN2蛋白表达显著上升(P <0.05);逆转组介于过表达组和抑制组之间(P <0.05)。野生型ITLN2+miR-515的荧光强度显著下降(P <0.05)。结论 miR-515可以负调控ITLN2的表达,促进ESCs细胞的增殖、侵袭和转移,抑制ESCs细胞的凋亡。 展开更多

关键词 微小RNA-515 凝集素2 子宫内膜间质细胞 荧光素酶报告基因实验 卵巢型子宫内膜异位症

原文传递

LncRNA MALAT-1靶向microRNA-370-3p调节Akt通路对肺癌细胞生物学行为影响的机制研究 被引量：1

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作者 李亮 李建忠 +2 位作者 张丹杰 马跃峰 李少民 《中国现代医学杂志》 CAS 北大核心 2023年第3期38-47,共10页

目的 探讨长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子-1(LncRNA MALAT-1)是否能靶向调节microRNA-370-3p(miR-370-3p)的表达,以及对Akt通路和肺癌细胞生物学行为的影响。方法 选用非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞体外培养,分别抑制LncRNA MALAT... 目的 探讨长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子-1(LncRNA MALAT-1)是否能靶向调节microRNA-370-3p(miR-370-3p)的表达,以及对Akt通路和肺癌细胞生物学行为的影响。方法 选用非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞体外培养,分别抑制LncRNA MALAT-1(转染si-MALAT-1)或过表达miR-370-3p(转染miR-370-3p mimic),抑制LncRNA MALAT-1和干扰miR-370-3p(同时转染si-MALAT-1和antimiR-370-3p),观察A549细胞的生物学行为和Akt通路蛋白的表达。qRT-PCR检测LncRNA MALAT-1、miR-370-3p mRNA的表达;MMT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞迁移与侵袭;Western blotting检测Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白相对表达量。构建MALAT-1野生型(MALAT-1WT_1uc)与突变型(MALAT-1MUT_1uc)荧光素酶报告基因质粒并分别与miR-370-3p、miR-NC转染至A549细胞,观察荧光结合强度并检测miR-370-3p的表达。结果 抑制LncRNA MALAT-1或过表达miR-370-3p能抑制A549细胞迁移、侵袭,促进细胞凋亡,减少A549细胞活性(P <0.05),并下调p-Akt和p-PI3K蛋白的表达(P <0.05)。与单纯抑制LncRNA MALAT-1比较,抑制LncRNA MALAT-1并干扰miR-370-3p能促进A549细胞迁移、侵袭,抑制细胞凋亡,增加A549细胞活性(P <0.05),并上调p-Akt和p-PI3K蛋白的表达(P <0.05)。TargetScan靶基因预测发现LncRNA MALAT-1与miR-370-3p存在结合位点,荧光素酶报告基因实验验证发现,与MALAT-1WT_1uc+Control组和MALAT-1WT_1uc+miR NC组比较,MALAT-1WT_1uc+miR-370-3p组相对荧光强度下降(P <0.05),MALAT-1MUT_1uc+miR-370-3p荧光强度无变化(P>0.05),进一步qRT-PCR结果发现,与Control组比较,si-MALAT-1组的miR-370-3p mRNA相对表达量升高(P <0.05),与si-MALAT-1组比较,si-MALAT-1+anti-miR-370-3p组的miR-370-3pmRNA相对表达量降低(P <0.05)。结论LncRNA MALAT-1可以靶向负调控miR-370-3p。抑制LncRNA MALAT-1可以上调miR-370-3p的表达,抑制A549细胞的增殖、迁移及侵袭,促进A549细胞的凋亡,并下调Akt通路蛋白的磷酸化。 展开更多

关键词 肺癌 microRNA-370-3p 长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子-1 荧光素酶报告基因实验 AKT

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miR-320b靶基因预测与鉴定 被引量：1

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作者 邸亚男 马思思 +3 位作者 胡涵帅 李卫卫 张珍珠 王晋星一 《中国糖尿病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期12-16,共5页

目的寻找miR-320b靶基因,探讨其参与T2DM发生发展的分子机制。方法4种在线软件Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS和miRmap预测miR-320b靶基因。采用在线软件VENNY2.1选取4种预测结果交集。在线数据库String查询靶基因编码蛋白质间的相关... 目的寻找miR-320b靶基因,探讨其参与T2DM发生发展的分子机制。方法4种在线软件Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS和miRmap预测miR-320b靶基因。采用在线软件VENNY2.1选取4种预测结果交集。在线数据库String查询靶基因编码蛋白质间的相关性,筛选其候选靶基因。采取全基因合成方式合成野生型及突变型靶基因双荧光素酶重组Psicheck-2质粒载体,Sanger测序鉴定重组质粒是否构建成功。选取对数生长期293T细胞分为6组:野生型质粒+miRNA阴性对照组(Psicheck2-PTEN-WT+NC)和野生型质粒+miR-320b mimic组(Psicheck2-PTEN-WT+mimic);突变型质粒+miRNA阴性对照组(Psicheck2-PTEN-Mut+NC)和突变型质粒+miR-320b mimic组(Psicheck2-PTEN-Mut+mimic);空质粒载体+miRNA阴性对照组(Psicheck2-NC+NC)和空质粒载体+miR-320b mimic组(Psicheck2-NC+mimic)。各组进行相应质粒和miRNAs共转染,检测双荧光素酶活性。结果4种在线软件Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS和miRmap预测miR-320b靶基因数分别为847、1045、806和6208,VENNY2.1取交集后得到66个共同靶基因。在线数据库String显示,66个靶蛋白之间的相关性主要集中在以人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)为核心的蛋白。双荧光素酶报告基因实验显示,Psicheck2-PTEN-WT+miR320b组荧光素酶活性比值低于Psicheck2-PTEN-WT+NC组(P<0.05)。结论miR-320b作用于靶基因PTEN的3’UTR,为探讨miR-320b参与T2DM发生发展提供依据。 展开更多

关键词 miR-320b 双荧光素酶报告基因实验 靶基因

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48孔板荧光素酶报告基因实验边缘效应 被引量：3

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作者 廖丹 徐云飞 +1 位作者 孟莎莎 周卫辉 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期3792-3798,共7页

为了研究48孔板荧光素酶报告基因实验边缘效应以及寻找可能消除边缘效应的方法措施。本研究用常规方法培养人胚肾细胞HEK293,运用脂质体转染试剂Lipofectamin 2000将荧光素酶报告基因质粒p GL4.13Z和内参质粒p RL-TK共转染入48孔板中的H... 为了研究48孔板荧光素酶报告基因实验边缘效应以及寻找可能消除边缘效应的方法措施。本研究用常规方法培养人胚肾细胞HEK293,运用脂质体转染试剂Lipofectamin 2000将荧光素酶报告基因质粒p GL4.13Z和内参质粒p RL-TK共转染入48孔板中的HEK 293细胞。转染后24 h用荧光素酶报告基因实验检测试剂测量细胞的荧光素酶活性,比较角落孔、边缘孔以及中间孔测定值的差异,以及内参照海肾荧光素酶活性校准后的差值,并通过细胞计数来观察此种差异是否与细胞数目和转染效率相关。在此基础上,寻找可能减小边缘效应的方法,如细胞种植入48孔板后将其室温静置、48孔板重叠、放弃使用边缘孔。运用48孔细胞培养板进行荧光素酶报告基因实验存在边缘效应,边缘孔与中间孔的荧光素酶活性测定值有显著的差异且有统计学意义（p〈0.05）,而边缘效应的产生与细胞数目和转染效率无明显关联。细胞种植入48孔板后将其室温静置1.5 h、或重叠一个48孔板以及空置边缘孔都不能减弱边缘效应;然而将48孔板四周边缘孔填充液体（磷酸盐缓冲液（1＊PBS）,水）,可以削弱边缘效应。用48孔细胞培养板进行荧光素酶报告基因实验会产生边缘效应,并可能造成对实验结果的误判;48孔板四周边缘孔填充相应的液体可以削弱边缘效应。 展开更多

关键词 荧光素酶报告基因实验 边缘效应 48孔板

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Hsa-miR-98-5p/DKK3信号轴对乳腺癌细胞生物学行为的影响 被引量：3

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作者 姚嘉 李冠乔 +1 位作者 杨时平 苏慧銮 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期807-816,共10页

背景与目的:乳腺癌威胁着全世界女性的健康。虽然已发现大量微小RNA(microRNA,miRNA)在乳腺癌中异常表达,但仍需要构建一个完整的miRNA-信使RNA(messenger RNA,mRNA)网络。方法:利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据... 背景与目的:乳腺癌威胁着全世界女性的健康。虽然已发现大量微小RNA(microRNA,miRNA)在乳腺癌中异常表达,但仍需要构建一个完整的miRNA-信使RNA(messenger RNA,mRNA)网络。方法:利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载乳腺癌相关数据集,分析肿瘤组织与正常组织之间差异表达的miRNA。利用miRDB、miRTarBase和StarBase数据库分析差异miRNA靶向的基因。使用R语言中的ClusterProfiler包对靶基因进行富集分析。使用String数据库联合Cytoscape 3.6.2软件进行蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络分析及Hub基因的筛选;构建miRNA-Hub mRNA调控网络确定研究信号轴,然后通过细胞实验进行验证。结果:采用TCGA数据集识别出两个差异miRNAs。3个数据库取交集预测得到278个靶基因。共鉴定出10个Hub基因,从构建的miRNA-Hub基因网络图中发现,hsa-miR-98-5p/DKK3轴可能在乳腺癌的进展中起关键作用。细胞功能学实验证实hsa-miR-98-5p可抑制细胞凋亡,促进细胞的增殖、迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因实验进一步验证了hsa-miR-98-5p与DKK3的结合作用。结论:本研究首先通过生物信息学分析鉴定出一个与乳腺癌进展相关的hsa-miR-98-5p/DKK3轴,初步证实hsa-miR-98-5p可通过靶向DKK3抑制乳腺癌细胞凋亡,促进细胞的增殖、迁移和侵袭。 展开更多

关键词 乳腺癌 Hsa-miR-98-5p DKK3 双荧光素酶活性报告实验

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MiR-381通过靶向基质细胞衍生因子-1对多发性肌炎组织浸润的巨噬细胞的作用机制 被引量：1

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作者 陈昭英 洪文轲 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期183-189,共7页

目的 探讨miR-381通过靶向基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对多发性肌炎(PM)组织浸润的巨噬细胞的作用机制。方法 通过兔肌球蛋白(1.5 mg)、结核分枝杆菌(5 mg)和百日咳毒素(500 ng)构建PM小鼠模型。将30只PM模型小鼠随机分为PM组和PM+miR-38... 目的 探讨miR-381通过靶向基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对多发性肌炎(PM)组织浸润的巨噬细胞的作用机制。方法 通过兔肌球蛋白(1.5 mg)、结核分枝杆菌(5 mg)和百日咳毒素(500 ng)构建PM小鼠模型。将30只PM模型小鼠随机分为PM组和PM+miR-381组(每组15只),另取同期15只健康小鼠作为对照组。PM+miR-381组小鼠腹腔内注射miR-381 agomir(300μg)2周。检测和比较各组小鼠血清中血清肌酸激酶(s-CK)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6水平及肌肉组织病理学变化。通过免疫组织化学染色检测巨噬细胞标志蛋白F4/80,评估组织中浸润的巨噬细胞情况,检测各组肌肉组织中miR-381、SDF-1 mRNA和蛋白表达水平。通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-381和SDF-1的靶向关系。将小鼠巨噬细胞分为miR-381 NC组和miR-381 mimics组,通过转染miR-381 mimics过表达miR-381,通过Real-time PCR和Western blotting检测各组SDF-1 mRNA和蛋白水平,通过Transwell实验检测细胞迁移水平评估侵袭能力。结果 动物实验上述指标3组间差异显著(P<0.05)。PM组肌肉组织中miR-381水平显著低于对照组,s-CK、IL-1β、IL-6、组织学评分、组织中浸润的巨噬细胞情况、SDF-1 mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。PM+miR-381组肌肉组织中miR-381水平显著高于PM组,s-CK、 IL-1β、IL-6、组织学评分、组织中浸润的巨噬细胞情况、SDF-1 mRNA和蛋白表达水平显著低于PM组(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-381可以与SDF-1靶向结合。细胞实验结果表明,miR-381 mimics组巨噬细胞中的SDF-1 mRNA和蛋白表达水平显著低于miR-381 NC组(P<0.05)。MiR-381 mimics组的迁移细胞数目显著低于miR-381 NC组(P<0.05)。结论 提高miR-381水平可通过靶向抑制SDF-1的表达而抑制巨噬细胞的炎性浸润能力,从而缓解PM。 展开更多

关键词 多发性肌炎 基质细胞衍生因子-1 巨噬细胞浸润 免疫组织化学 双荧光素酶报告基因实验 小鼠

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BMP4基因稀有突变与先天性心脏病易感性的相关性研究 被引量：2

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作者 彭瑞 李培强 +3 位作者 程良平 郑煜芳 王红艳 周翔宇 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期3605-3610,共6页

小鼠模型研究已表明骨形态发生蛋白4（Bmp4）缺陷引起心脏结构异常等表型。为了进一步探索BMP4基因新发稀有错义突变与中国汉族人群中先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）发生的相关性,本实验中我们选取来自山东的417例CHD患... 小鼠模型研究已表明骨形态发生蛋白4（Bmp4）缺陷引起心脏结构异常等表型。为了进一步探索BMP4基因新发稀有错义突变与中国汉族人群中先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）发生的相关性,本实验中我们选取来自山东的417例CHD患者血液样本和213例正常对照样本,利用靶向捕获技术对BMP4基因编码区进行深度测序。我们一共检测到5个病例特有的稀有突变位点,其中3个错义突变（c.326G〉T,c.485G〉A,c.632G〉A）在公共数据库中没有记录,且在不同物种中高度保守。双荧光素酶报告基因实验结果表明c.326G〉T和c.632G〉A显著下调NIH3T3细胞的BMP信号通路的活性。我们的研究表明BMP4中新发现的病例特有的稀有错义突变可能通过下调BMP信号通路活性而导致先天性心脏病的发生。 展开更多

关键词 先天性心脏病(CHD) BMP信号通路 BMP4 靶向捕获技术 双荧光素酶报告基因实验

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MicroRNA-181b对2型糖尿病胰岛素分泌调节的作用及其机制研究

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作者 曾维新 云川 +1 位作者 李晓燕 李大伟 《中国现代医学杂志》 CAS 北大核心 2022年第10期30-35,共6页

目的探讨microRNA-181b(miR-181b)能否通过靶向调控NDRG2参与2型糖尿病胰岛素分泌的调节。方法选用小鼠胰岛β细胞进行体外传代培养,构建NDRG2野生型(NDRG2^(WT)-1uc)与突变型(NDRG2^(MUT)-1uc)荧光素酶报告基因质粒并进行转染,转染结... 目的探讨microRNA-181b(miR-181b)能否通过靶向调控NDRG2参与2型糖尿病胰岛素分泌的调节。方法选用小鼠胰岛β细胞进行体外传代培养,构建NDRG2野生型(NDRG2^(WT)-1uc)与突变型(NDRG2^(MUT)-1uc)荧光素酶报告基因质粒并进行转染,转染结束后进行双荧光素酶报告分析。构建NDRG2过表达和敲低质粒并转染小鼠胰岛β细胞,检测NDRG2 mRNA和蛋白表达、胰岛素分泌量。未转染的小鼠胰岛β细胞培养48 h后采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-181b和NDRG2 mRNA的表达。采用葡萄糖刺激的胰岛素释放试验检测5 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖条件下的小鼠胰岛β细胞分泌的胰岛素。结果(1)荧光素酶报告基因实验检测发现,各组相对荧光强度比较,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-181b模拟物可以明显抑制NDRG2^(WT)-luc的3’端非翻译区的表达,但对NDRG2-MUT组和Control组无明显影响;miR-181b inhibitor可以加强NDRG2^(WT)-luc的3’-端非翻译区的表达,但对NDRG2-MUT组和Control组无明显影响。(2)过表达组NDRG2 mRNA和蛋白相对表达量高于过表达对照组(P<0.05);在5 mmol/L葡萄糖条件下,过表达组与过表达对照组胰岛素分泌量比较,差异无统计学意义(P>0.05);在20 mmol/L葡萄糖条件下,过表达对照组胰岛素分泌量高于过表达组(P<0.05)。敲低组NDRG2 mRNA和蛋白相对表达量低于敲低对照组(P<0.05);在5 mmol/L葡萄糖条件下,敲低组与敲低对照组胰岛素分泌量比较,差异无统计学意义(P>0.05);在20 mmol/L葡萄糖条件下,敲低组胰岛素分泌量高于敲低对照组(P<0.05)。(3)5 mmol/L葡萄糖组与对照组的miR-181b和NDRG2 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05);20 mmol/L葡萄糖组miR-181b相对表达量高于对照组和5 mmol/L葡萄糖组(P<0.05),NDRG2 mRNA相对表达量低于对照组和5 mmol/L葡萄糖组(P<0.05)。(4)5 mmol/L葡萄糖条件下,Control组、miR-181b mimics组、miR-181b inhibitor组胰岛素分泌量比较,� 展开更多

关键词 2型糖尿病 microRNA-181b NDRG2 荧光素酶报告基因实验 胰岛素

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