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葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立 被引量：20
1
作者 范旭东 董雅凤 +2 位作者 张尊平 任芳 李亚惠 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期949-956,共8页
以复合感染4种病毒的‘红地球’(Red Globe)葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3(Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3)... 以复合感染4种病毒的‘红地球’(Red Globe)葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3(Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3)、沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV)、葡萄病毒B(Grapevine virusB,GVB)和葡萄病毒A(Grapevine virusA,GVA)的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。 展开更多
关键词 多重RT-PCR 检测 葡萄卷叶伴随病毒3 沙地葡萄茎痘病毒 葡萄病毒B 葡萄病毒A
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基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的葡萄卷叶伴随病毒3号检测方法 被引量：17
2
作者 张娜 乾义柯 +6 位作者 魏霜 胡白石 陆平 赛铁尔汗 刘中勇 张永江 张祥林 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期302-308,共7页
【目的】建立一种快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测葡萄卷叶伴随病毒3(Grapevine leafroll-associated virus 3,GLRaV-3)方法。【方法】根据GLRaV-3已测序和已报道的HSP70基因(Heat shock protein 70)保守序列,设计用于RPA检... 【目的】建立一种快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测葡萄卷叶伴随病毒3(Grapevine leafroll-associated virus 3,GLRaV-3)方法。【方法】根据GLRaV-3已测序和已报道的HSP70基因(Heat shock protein 70)保守序列,设计用于RPA检测的特异性引物,建立GLRaV-3的RPA检测方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。【结果】建立RPA检测方法能够从GLRaV-3带毒株中检测到约380 bp的特异性条带,仅需在37℃下恒温反应40 min,无需特殊的仪器设备,经特异性评价特异性好,且该方法与普通PCR检测灵敏度基本一致。【结论】建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合GLRaV-3的快速检测方法。 展开更多
关键词 葡萄卷叶伴随病毒3 RPA 检测方法
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葡萄卷叶伴随病毒-3 RT-LAMP检测体系的建立与应用 被引量：1
3
作者 张强强 王雯雯 +3 位作者 闫思远 李玲 王若彤 顾沛雯 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期2166-2174,共9页
为实现葡萄生产中对葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3)的快速检测。本研究以GLRaV-3的CP基因序列(GenBank登录号:KC477128.1)为靶序列设计并合成了3对逆转录环介导恒温扩增技术(RTLAMP)引物,建立并优化GLRaV-3的RT-LAMP检测方法。结果表明,... 为实现葡萄生产中对葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3)的快速检测。本研究以GLRaV-3的CP基因序列(GenBank登录号:KC477128.1)为靶序列设计并合成了3对逆转录环介导恒温扩增技术(RTLAMP)引物,建立并优化GLRaV-3的RT-LAMP检测方法。结果表明,该方法能够实现在恒温64℃下反应1 h完成对GLRaV-3的检测,引物GLRaV3-LAMP-Ⅰ特异性高,不与GLRaV-1~2、葡萄扇叶病毒、沙地葡萄茎痘相关病毒、葡萄病毒A、灰皮诺葡萄病毒和葡萄浆果内坏死病毒等7种葡萄常见病毒发生交叉反应;RNA最低检测限为10 pg·μL^(-1),灵敏度是逆转录PCR(RT-PCR)的10倍。田间样品检测验证结果表明,该方法与常规RT-PCR法检测一致率为100%。综上,本研究建立的GLRaV-3 RT-LAMP检测体系具有高特异性、高灵敏度和实用性强等特点,可应用于田间葡萄卷叶病样的检测。 展开更多
关键词 葡萄卷叶伴随病毒3 RT-LAMP 引物筛选 反应条件优化 田间检测
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葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ宁夏分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析 被引量：5
4
作者 顾沛雯 《宁夏大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2009年第4期383-386,共4页
用酶联免疫吸附法对宁夏贺兰山东麓地区不同葡萄品种进行卷叶伴随病毒Ⅲ(GLRaVⅢ)的测定,检测率为37.1%,与田间自然发病率调查结果基本一致.设计GLRaVⅢ外壳蛋白(CP)基因序列引物对,进行RT-PCR扩增,获得1.1 kb的特异片段.其中,CP基因长9... 用酶联免疫吸附法对宁夏贺兰山东麓地区不同葡萄品种进行卷叶伴随病毒Ⅲ(GLRaVⅢ)的测定,检测率为37.1%,与田间自然发病率调查结果基本一致.设计GLRaVⅢ外壳蛋白(CP)基因序列引物对,进行RT-PCR扩增,获得1.1 kb的特异片段.其中,CP基因长942 bp,推导的编码蛋白含有313个氨基酸.通过对GLRaVⅢCP基因同源性比较,结果表明,GLRaVⅢ宁夏分离物的CP基因与四川分离物SL-10 CP基因的亲缘关系最近,核苷酸和所编码的氨基酸序列同源性分别为98.8%和98.1%;与巴西分离物PET-4和智利分离物C1-817 CP基因亲缘关系较远,核苷酸序列同源性低于95.0%,所编码的氨基酸序列同源性低于97.0%,认为GLRaVⅢ株系间的CP基因存在差异. 展开更多
关键词 葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ(GLRaVⅢ) 宁夏分离物 CP基因 克隆和序列分析
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3种葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR检测 被引量：2
5
作者 王仲 刘命华 +2 位作者 李捷 李明骏 程玉琴 《中国果树》 北大核心 2012年第4期43-46,I0002,共5页
2010—2011年我们对河北省涿鹿、怀来、昌黎、宣化等县(区)以及北京市葡萄卷叶病的发生情况进行了调查,并对采集的葡萄植株样品用RT-PCR方法检测病毒种类。在检测的82个样品中,葡萄卷叶伴随病毒3号(GLRaV-3)的检出率为100.0%,葡萄卷叶... 2010—2011年我们对河北省涿鹿、怀来、昌黎、宣化等县(区)以及北京市葡萄卷叶病的发生情况进行了调查,并对采集的葡萄植株样品用RT-PCR方法检测病毒种类。在检测的82个样品中,葡萄卷叶伴随病毒3号(GLRaV-3)的检出率为100.0%,葡萄卷叶伴随病毒1号(GLRaV-1)的检出率为17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号(GLRaV-2)的检出率为11.0%;病毒混合侵染的样品占总检测样品数的28.1%,其中葡萄卷叶伴随病毒1号、3号混合侵染样品占总检测样品数的17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号、3号混合侵染的样品占总检测样品数的11.0%,且在这些被病毒混合侵染的样品中,有2个样品被葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号三重侵染。 展开更多
关键词 葡萄卷叶病 葡萄卷叶伴随病毒1号 葡萄卷叶伴随病毒2号 葡萄卷叶伴随病毒3号 RT-PCR
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葡萄卷叶伴随病毒基因的克隆及序列分析 被引量：5
6
作者 张满良 朱水芳 赵冬兰 《西北农业大学学报》 CSCD 北大核心 2000年第5期70-75,共6页
根据葡萄卷叶伴随病毒 美国分离物的 GLRa V- 3CP基因序列 ,设计并合成了 1对该病毒的 PCR引物 ,利用 IC- RT- PCR成功地检查到合适大小的 PCR产物 ;同时将PCR产物克隆到中间载体 PGEM- 3Zf上 ,转化大肠杆菌 DH5α菌株 ,筛选阳性克隆... 根据葡萄卷叶伴随病毒 美国分离物的 GLRa V- 3CP基因序列 ,设计并合成了 1对该病毒的 PCR引物 ,利用 IC- RT- PCR成功地检查到合适大小的 PCR产物 ;同时将PCR产物克隆到中间载体 PGEM- 3Zf上 ,转化大肠杆菌 DH5α菌株 ,筛选阳性克隆。通过双酶切以及序列分析表明 ,扩增样品与美国分离物的同源性为 94.1 %。 展开更多
关键词 CP基因 克隆 序列分析 葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ 葡萄卷叶病
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葡萄卷叶伴随病毒-3复制酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量：2
7
作者 徐章逸 王国平 洪霓 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期252-255,共4页
以感染有葡萄卷叶伴随病毒-3(Grapevineleafroll-associatedvirus-3,GLRaV-3)的葡萄韧皮部组织中提取到的dsRNA为模板,利用RT-PCR和重叠延伸PCR技术,对GLRaV-3的复制酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRp)基因进行克隆,获得了预期大小的... 以感染有葡萄卷叶伴随病毒-3(Grapevineleafroll-associatedvirus-3,GLRaV-3)的葡萄韧皮部组织中提取到的dsRNA为模板,利用RT-PCR和重叠延伸PCR技术,对GLRaV-3的复制酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRp)基因进行克隆,获得了预期大小的目标片段。将此片段克隆到载体pBluescriptSKⅡ,酶切鉴定后测序。测序结果表明:RdRpcDNA全长为1618bp。经BLAST分析推导其可能编码538个氨基酸,与报道的GLRaV-3美国分离物NY1RdRp核苷酸相似性为99.3%,氨基酸相似性为99.6%;推导的氨基酸序列与其同属的PMWaV-2、GLRaV-1和LChV-2的RdRp氨基酸序列相似性分别为53%,50%和38%,包含了GDD在内的8个保守基元序列。将该段RdRp连接到表达载体pET22b(+)上,获得的重组子pET-RdRp转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后,用1mmol/L的IPTG进行诱导。SDS-PAGE分析表明,RdRp在大肠杆菌中被诱导表达,融合蛋白分子量约为61kDa。 展开更多
关键词 葡萄卷叶伴随病毒-3 复制酶 反转录-聚合酶联反应 原核表达
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葡萄卷叶伴随病毒ⅢCP基因在E.coli中的表达 被引量：1
8
作者 赵冬兰 朱水芳 +2 位作者 张满良 张成良 黄文胜 《西北农业大学学报》 CSCD 北大核心 2001年第1期88-90,共3页
将葡萄卷叶伴随病毒 的 CP基因克隆到表达载体 p ET- 30 a中 ,转化大肠杆菌 BL2 1,筛选得到阳性克隆 GB- 1,用 IPTG诱导使其表达。SDS- PAGE电泳分析表明 ,该 CP基因在大肠杆菌 BL2 1中得到大量表达。用该病毒的 CP抗血清通过间接 EL
关键词 葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ CP基因 基因表达 基因克隆
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葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析 被引量：12
9
作者 王建辉 刘建军 +3 位作者 陈克玲 李洪雯 席德慧 林宏辉 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期2401-2410,共10页
葡萄卷叶伴随3型病毒(Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3)和葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量RT-PCR与qRT-PCR方法研究了‘希姆劳特’葡萄(Vitis vinifera L.×V.labr... 葡萄卷叶伴随3型病毒(Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3)和葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量RT-PCR与qRT-PCR方法研究了‘希姆劳特’葡萄(Vitis vinifera L.×V.labrusca L.‘Himrod’)中不同组织内病毒的相对积累量,结果表明叶脉和韧皮部内的病毒相对积累量显著高于其他组织。以成熟枝条韧皮部组织的cDNA为模板,优化了RT-PCR多重扩增体系,可以同时扩增待测样本中两种病毒的目标基因。从一株复合感染GLRaV-3与GVA的‘藤稔’葡萄(Vitis vinifera L.×V.labrusca L.‘Fujiminori’)中,分别克隆了GLRaV-3外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长序列和GVA部分基因组区域序列,后者包括CP基因的部分序列与病毒RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing,VSR)基因全长序列。病毒核酸同源性分析与系统进化研究表明,不同GLRaV-3分离物的CP高度保守;而‘藤稔’葡萄的GVA分离物包含多种变异株,具有准种病毒的特点。 展开更多
关键词 葡萄 葡萄卷叶伴随3型病毒 葡萄A病毒 病毒外壳蛋白基因 病毒RNA沉默抑制子基因 RT-PCR多重检测 病毒变异株
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