基于CRISPR技术构建发光噬菌体及其在大肠埃希菌鉴定中的应用

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作者 李民伟 颜菁 +8 位作者 李航逸 郝治云 倪忠 胡朝阳 王笑蓉 许梦寒 王驰 李芮冰 王成彬 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期437-443,共7页

目的构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体(HT7),并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg(1~10)和PFN-1000同源重组质粒菌株,并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA(sgRNA);采用同源... 目的构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体(HT7),并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg(1~10)和PFN-1000同源重组质粒菌株,并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA(sgRNA);采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)系统联合介导的基因编辑技术,将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区,并成功构建发光噬菌体HT7;通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异;此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果构建的10个CRISPR靶向切割系统中,sgRNA8靶标的切割效率最高,成斑效率为0.18;噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-10003质粒系统3轮重组筛选后,PCR验证均为2798 bp的重组噬菌体条带,说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率(P<0.001)、一步生长曲线(P=0.001)、感染复数(P=0.031)的生物特性分析中,均有显著差异,裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min,最佳感染复数为0.1;临床样本测试,可识别裂解6株大肠埃希菌,其余菌株均不裂解,4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。结论成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统,并成功构建发光噬菌体HT7,该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌,且对其他菌株无裂解作用,显示出良好的检测专一性和低检出限。 展开更多

关键词 细菌噬菌体 基因编辑 大肠杆菌 萤光素酶类 同源重组

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间充质干细胞来源的外泌体抑制乳腺癌细胞生长的研究 被引量：5

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作者 何宁宁 王津晗 +6 位作者 王彦 杜利清 徐畅 冯宇 孙晓辉 蔡慧 刘强 《天津医药》 CAS 北大核心 2019年第6期600-604,共5页

目的研究脐带间充质干细胞来源的外泌体(MSCs-Exo)对乳腺癌细胞生长的影响。方法利用生物发光成像技术的双报告基因(萤火虫荧光素酶-绿色荧光蛋白,Fluc-GFP)载体,通过慢病毒转染构建人乳腺癌MDA-MB-231细胞系(231-Fluc-GFP),以便在体内... 目的研究脐带间充质干细胞来源的外泌体(MSCs-Exo)对乳腺癌细胞生长的影响。方法利用生物发光成像技术的双报告基因(萤火虫荧光素酶-绿色荧光蛋白,Fluc-GFP)载体,通过慢病毒转染构建人乳腺癌MDA-MB-231细胞系(231-Fluc-GFP),以便在体内可以对细胞进行实时监测。分别采用MSCs-Exo( MSCs-Exo组)和PBS(对照组)处理细胞,体外实验对2组细胞进行形态学观察、增殖、存活、STAT3及其下游基因表达的检测;通过皮下注射2组细胞建立裸鼠体内乳腺癌模型,对不同处理条件下的细胞成瘤情况进行分析。结果体外实验结果显示MSCs-Exo处理后乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖受到了抑制,在处理第3天时2组细胞数差异有统计学意义(P<0.05);处理后细胞存活率降低(P<0.01);外泌体处理组STAT3及其下游基因C-MYC,BCL-XL,NANOG,OCT4,SOX2表达下降。体内实验结果显示MSCs-Exo处理组肿瘤细胞在体内的生长受到抑制。结论脐带间充质干细胞来源的外泌体抑制乳腺癌细胞的生长。 展开更多

关键词 间充质基质细胞 外泌体 乳腺肿瘤 发光测定法 萤光素酶类

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miR-103a-3p对肝细胞癌细胞迁移能力的影响及其作用机制 被引量：3

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作者 徐倩 廖肇忠 +3 位作者 刘文靓 华君男 王喆 李宁 《精准医学杂志》 2021年第1期14-18,23,共6页

目的探讨miR-103a-3p对肝细胞癌(HCC)细胞迁移能力的影响及其作用机制。方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-103a-3p在正常肝细胞L02和HCC细胞系Hccl-M3中的表达;将Hccl-M3细胞按照实验要求分为A、B、C、D、E组,各组分别转染mim... 目的探讨miR-103a-3p对肝细胞癌(HCC)细胞迁移能力的影响及其作用机制。方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-103a-3p在正常肝细胞L02和HCC细胞系Hccl-M3中的表达;将Hccl-M3细胞按照实验要求分为A、B、C、D、E组,各组分别转染mimics NC、miR-103a-3p mimics、inhibitor NC、miR-103a-3p inhibitor以及miR-103a-3p mimics与TMEM166-Myc,采用Western blot方法检测miR-103a-3p对内质网跨膜蛋白TMEM166表达的影响;通过细胞划痕法检测miR-103a-3p表达对Hccl-M3细胞迁移能力的影响;通过micro-RNA靶基因数据库starBase预测miR-103a-3p与TMEM166可能的结合位点;将293T细胞分为F、G、H以及I组,各组分别转染mimics NC与TMEM166-3UTR-wt、miR-103a-3p mimics与TMEM166-3UTR-wt、mimics NC与TMEM166-3UTR-mu、miR-103a-3p mimics与TMEM166-3UTR-mu,检测每组细胞中荧光素酶活性,分析miR-103a-3p对TMEM166的靶向调控作用。结果RT-qPCR法检测结果显示,HCC细胞系Hccl-M3中miR-103a-3p的表达高于正常肝细胞L02(t=13.49,P<0.05)。Western blot检测结果显示,组间细胞TMEM166蛋白表达水平比较差异有显著性(F=276.20,P<0.05);B组细胞TMEM166蛋白表达水平低于A组(t=22.33,P<0.05),D组细胞TMEM166蛋白表达水平高于C组(t=9.72,P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,组间细胞荧光素酶活性比较差异有显著性(F=122.90,P<0.05),G组细胞荧光素酶活性显著低于F组(t=23.17,P<0.05)。划痕实验结果显示,组间细胞迁移率比较差异有显著性(F=16.83,P<0.05);B组细胞迁移率明显高于A组(t=4.13,P<0.05),D组细胞迁移率明显低于C组(t=4.33,P<0.05),E组细胞迁移率明显低于B组(t=4.91,P<0.05)。结论miR-103a-3p通过抑制TMEM166的表达促进HCC细胞系Hccl-M3的迁移。 展开更多

关键词 癌 肝细胞 微RNAS 膜蛋白质类 内质网 基因表达 蛋白质生物合成 细胞运动 萤光素酶类

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基于双荧光素酶报告基因系统的人源SREBP1基因启动子的活性研究 被引量：2

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作者 杨念 李琛 +4 位作者 李洪亮 郑燕 房树华 汪选斌 赵雅玮 《天津医药》 CAS 北大核心 2019年第9期897-902,共6页

目的构建固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。方法利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5 000 bp序列进行启动子预测与分析。应用Gibson Assembl... 目的构建固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。方法利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5 000 bp序列进行启动子预测与分析。应用Gibson Assembly方法构建启动子双荧光素酶载体,并将构建成功的pGL3-SREBP1-pro重组质粒和内参质粒p RL-SV40共转染肝癌HepG2细胞并给予天然抑制剂大黄素,检测SREBP1转录活性的抑制效果。结果 SREBP1基因5′端上游2 000 bp区域内有启动子特征序列,存在转录因子结合位点;重组质粒经酶切及测序鉴定证实为阳性克隆,瞬时转染肝癌HepG2细胞后经双荧光素酶报告基因系统检测,所克隆的片段序列具有启动子活性,该活性可被大黄素所抑制。结论成功构建了pGL3-SREBP1-pro双荧光素酶报告基因表达载体,并证实其活性,可为进一步用于针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。 展开更多

关键词 固醇调节元件结合蛋白1 转录启动子 基因 报告 萤光素酶类 大黄素 蒽醌类 生物信息学

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细胞分裂周期蛋白2启动子报告基因载体的构建与鉴定 被引量：2

5

作者 周辉 吴炜 赵明 《天津医药》 CAS 北大核心 2014年第2期101-104,共4页

目的构建细胞分裂周期蛋白2(Cdc2)基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,并检测其转录活性。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的Cdc2启动子序列并设计两端引物,扩增人基因组DNA中的Cdc2启动子。用限制性内切酶SacⅠ和Xh... 目的构建细胞分裂周期蛋白2(Cdc2)基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,并检测其转录活性。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的Cdc2启动子序列并设计两端引物,扩增人基因组DNA中的Cdc2启动子。用限制性内切酶SacⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和Cdc2启动子后,将Cdc2基因启动子插入到pGL3-Basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-Cdc2-promoter。将其与内参质粒pRL-SV40瞬时共转染骨肉瘤细胞U2OS,检测双荧光素酶活性。结果成功构建Cdc2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-Cdc2-promoter/pRL-SV40组荧光素酶活性为1.591 5±0.199 8,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40组的荧光素酶活性值0.049 9±0.010 4。结论 pGL3-Cdc2-promoter在骨髓瘤细胞U2OS细胞中能被转录激活,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础。 展开更多

关键词 细胞周期蛋白类 细胞周期蛋白质依赖激酶类 转录启动子 细胞周期 萤光素酶类

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心房颤动相关微小RNA4279靶向调控钙通道蛋白 被引量：1

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作者 李龙 苏迎 杨水祥 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 2015年第12期1257-1260,共4页

目的采用双荧光素酶报告基因等手段,探讨心房颤动(房颤)相关微小RNA4279(miR-4279)与房颤相关离子通道蛋白的靶向调控关系。方法利用在线数据库Targetscan,miRanda,miRDB预测可能的靶基因后,分别将靶基因的重组荧光素酶报告质粒与miR-4... 目的采用双荧光素酶报告基因等手段,探讨心房颤动(房颤)相关微小RNA4279(miR-4279)与房颤相关离子通道蛋白的靶向调控关系。方法利用在线数据库Targetscan,miRanda,miRDB预测可能的靶基因后,分别将靶基因的重组荧光素酶报告质粒与miR-4279及阴性对照质粒共转染于人胚胎肾HEK293细胞,实验分为转染组,阴性组和空白组检测各组相对荧光素酶的活性。并将miR-4279模拟体导入大鼠胚胎心肌H9c2细胞,观察其对靶基因的表达调控。结果 CACNA1C基因转染中,与阴性组比较,转染组相对荧光素酶活性降低18%(0.300±0.012 vs 0.366±0.011,P<0.01),转染组CACNA1C基因mRNA表达水平下调31%(0.820±0.058 vs 1.193±0.060,P<0.01),miR-4279模拟体转入H9c2细胞可抑制CACNA1C基因的表达。结论电压门控L型钙通道α亚基CACNA1C基因可能是miR-4279的直接靶基因,miR-4279可能通过抑制CACNA1C表达参与房颤电重构,有可能成为未来房颤干预治疗的靶点。 展开更多

关键词 心房颤动 萤光素酶类 基因表达调控 质粒 离子通道 转染

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NF-κB报告基因重组腺病毒的构建及活性分析 被引量：1

7

作者 郭金海 王峰 +3 位作者 王平章 赵丽 石太平 陈英玉 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期954-959,共6页

目的:探讨基于腺病毒载体的核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)报告基因系统作为NF-κB上游调控信号分子筛选模型的可行性。方法:利用5型E1/E3缺陷型腺病毒载体pAdxsi构建NF-κB报告基因的重组腺病毒,并利用该腺病毒感染多种贴壁细... 目的:探讨基于腺病毒载体的核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)报告基因系统作为NF-κB上游调控信号分子筛选模型的可行性。方法:利用5型E1/E3缺陷型腺病毒载体pAdxsi构建NF-κB报告基因的重组腺病毒,并利用该腺病毒感染多种贴壁细胞和悬浮细胞进行NF-κB报告基因的活性分析。结果:成功构建了NF-κB报告基因重组腺病毒Ad-NF-κB-luc,其能够感染HepG2、MGC803、THP-1、U937等细胞,肿瘤坏死因子α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)或脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激显示重组腺病毒携带的NF-κB报告基因具有活性。结论:以腺病毒Ad-NF-κB-luc作为NF-κB报告基因的转移载体,不仅可以感染常规方法难以转染的细胞系,而且产生的报告基因活性稳定可靠,拓展了NF-κB报告基因的应用范畴。 展开更多

关键词 NF-ΚB 腺病毒 基因 报告 萤光素酶类

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一种高效慢病毒转染小鼠肺方法的建立 被引量：1

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作者 王蕾 王晓英 +3 位作者 王玥 付秋霞 王东根 詹林盛 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第8期616-619,共4页

目的建立一种高效慢病毒转染小鼠肺的方法。方法采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和萤光素酶(luciferase,Luc)双基因标记慢病毒载体,通过293 FT细胞体外包装带有报告基因的慢病毒颗粒。选取BALB/c小鼠30只,每组15只,随... 目的建立一种高效慢病毒转染小鼠肺的方法。方法采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和萤光素酶(luciferase,Luc)双基因标记慢病毒载体,通过293 FT细胞体外包装带有报告基因的慢病毒颗粒。选取BALB/c小鼠30只,每组15只,随机分为高压喷雾注射组和普通注射组,小鼠手术暴露气管,经气道注射报告基因标记的慢病毒颗粒,观察慢病毒转染至肺后2、4、6、8、10、12 h小鼠存活率和呼吸系统表现,并在转染后24 h体外活体荧光成像仪检测报告基因在小鼠体内的发光强度。结果荧光显微镜下观察,见多数细胞表达GFP,并见细胞融合现象,少量细胞悬浮,病毒滴度为5×107U/ml。活体荧光成像结果显示,与普通注射方法相比,高压喷雾注射组报告基因荧光强度均匀分布在肺中,荧光强度较高,两组间表达强度比较差异有统计学意义(P=0.0095);且高压喷雾注射组小鼠气促、鼻唇黏膜发绀(cyanosis)较普通注射组恢复快,两组12 h存活率分别为80%和50%。结论高压喷雾注射技术转染慢病毒颗粒至小鼠肺的技术更为高效,可用于建立外源基因小鼠肺转染模型。 展开更多

关键词 慢病毒属 转染 高压喷雾注射 绿色荧光蛋白质类 萤光素酶类 肺 活体成像系统

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病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ对293T细胞APOBEC3G表达的影响 被引量：1

9

作者 郑国霞 刘如锦 +4 位作者 齐燕 王小波 闫玉涛 谭晓华 杨磊 《中华皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期624-630,共7页

目的探讨病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)表达的影响及其机制。方法转染vMIP-Ⅱ质粒(vMIP-Ⅱ质粒组)、空质粒(空质粒组)至293T细胞。定量PCR和Western 印迹法分析转染vMIP-Ⅱ基因对2... 目的探讨病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)表达的影响及其机制。方法转染vMIP-Ⅱ质粒(vMIP-Ⅱ质粒组)、空质粒(空质粒组)至293T细胞。定量PCR和Western 印迹法分析转染vMIP-Ⅱ基因对293T细胞APOBEC3G表达的影响。空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组细胞分别加入1 000 IU/ml干扰素α(IFN-α),培养36 h后,Western印迹法检测空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+ IFN-α组APOBEC3G的蛋白水平。对转染vMIP-Ⅱ质粒的293T细胞,分别用75 μmol/L JAK/STAT信号通路抑制剂AG490和20 μmol/LERK信号通路抑制剂U0126处理,24 h后收集细胞总蛋白,Western印迹法检测APOBEC3G蛋白水平。构建包含APOBEC3G启动子的荧光素酶报告基因重组质粒,启动子片段包括APOBEC3G全长启动子序列(POS)与长度1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp序列及APOBEC3G启动子序列中不含调控元件的区域(NEG),将荧光素酶报告基因重组质粒和vMIP-Ⅱ质粒共转染293T细胞为实验组,以与空质粒共转染的293T细胞为对照,检测APOBEC3G启动子活性,分析vMIP-Ⅱ调控APOBEC3G转录活性的关键启动子作用区域。统计学比较采用t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。结果 vMIP-Ⅱ转染组APOBEC3G mRNA、蛋白水平(2.500 ± 0.013、1.472 ± 0.013)均高于对照组(1、0.364 ± 0.030,t值分别为 6.22、6.54,均P < 0.05)。空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+ IFN-α组APOBEC3G水平(分别为1、2.030 ± 0.108、2.700 ± 0.081、2.600 ± 0.099)差异有统计学意义(F = 67.026,P < 0.001),vMIP-Ⅱ质粒组与空质粒+ IFN-α组差异无统计学意义(t = 3.46,P > 0.05)。vMIP-Ⅱ质粒组、vMIP-Ⅱ质粒+ AG490组、vMIP-Ⅱ质粒+ U0126组APOBEC3G水平(0.617 ± 0.025、0.179 ± 0.061、0.359 ± 0.012)差异有统计学意义(F = 70.019,P < 0.001),后两组均低于vMIP-Ⅱ质粒组(t值分别为9.66、11.836,P < 0.01)。荧光� 展开更多

关键词 HIV-1 肉瘤 卡波西 萤光素酶类 病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ 抗HIV-1基因 载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3G JAK-STAT信号通路

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人表面活性物质蛋白B基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒的构建及活性检测

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作者 王席娟 蔡保欢 +3 位作者 李文斌 刘伟 王靓 常立文 《中国医师杂志》 CAS 2013年第6期725-728,共4页

目的构建人表面活性物质蛋白-B（SP-B）基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒，并分析其在H441细胞中的转录活性。方法（1）以人基因组DNA为模板，PCR扩增SP-B启动子（-218／＋435bp）序列片段，并通过TA克隆方法连接到pGM-T载体上，筛... 目的构建人表面活性物质蛋白-B（SP-B）基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒，并分析其在H441细胞中的转录活性。方法（1）以人基因组DNA为模板，PCR扩增SP-B启动子（-218／＋435bp）序列片段，并通过TA克隆方法连接到pGM-T载体上，筛选阳性克隆将目的片段进行测序。测序鉴定正确后的目的片段被克隆到荧光素酶表达载体pGL3-Basic上构建pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒，酶切及测序鉴定重组质粒；（2）将构建的pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒酶切改造，sP-B启动子克隆进pGL4．17载体构建pGL4．17-SP-B-promoter重组质粒；经酶切及基因测序确认无误后，采用脂质体法将构建的两种重组质粒分别和内参质粒pRL-TK同时转染H441细胞，检测双荧光素酶活性。结果构建的重组质粒经酶切及测序鉴定完全正确，转染H441细胞后，检测细胞裂解液萤火虫荧光素酶（firefly）及海肾荧光素酶（renilla）活性，两者比值间接反映启动子活性，pGL3-basic／pGL4．17-SP-B-promoter重组质粒的firefly／reniUa比值（2．8±1．1、66．5±3．8）较空载体质粒pGL3-basic、pGIA．17（0．2±0．1，4．3±0．4）均明显升高（t=4．182，27．419，P=0．000）。pGL4．17重组质粒firefly／renilla比值明显高于pGL3-basic重组质粒，其差异有统计学意义（t=27．712，P=0．000）。结论成功构建具有sP-B基因转录活性的pGL3-basie／pGIA．17-SP-B-promoter重组质粒，oGL4．17萤组质粒荧光素酶活性高，为后续研究SP-B基因转录调控奠定了理论基础。 展开更多

关键词 肺表面活性剂 遗传学 启动区(遗传学) 萤光素酶类 遗传学 重组 遗传 转录 遗传 质粒 遗传学

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miR-138靶基因hTERT的生物信息学预测及鉴定

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作者 陈陵 陈先华 +4 位作者 梁光萍 范亚川 王国威 宋航 邹利全 《实用肿瘤杂志》 CAS 2013年第6期579-582,共4页

目的预测并鉴定miR-138的靶基因人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。方法采用生物信息学技术,预测miR-138与hTERT 3'UTR结合位点及结合后稳定性。分别采用RTqPCR、Western blot技术检测过表达miR-138... 目的预测并鉴定miR-138的靶基因人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。方法采用生物信息学技术,预测miR-138与hTERT 3'UTR结合位点及结合后稳定性。分别采用RTqPCR、Western blot技术检测过表达miR-138后MKN-45细胞内hTERT在mRNA与蛋白水平的变化。采用双荧光素酶实验及突变实验,验证miR-138与hTERT mRNA的结合位点。结果生物信息学技术预测显示,miR-138可稳定结合于hTERT 3'UTR。miR-138过表达后可明显抑制MKN-45细胞内hTERT蛋白表达水平(P<0.01),但对hTERT mRNA水平无显著影响(P>0.05)。双荧光素酶实验证实miR-138可稳定结合于hTERT 3'UTR相应位点。结论 miR-138通过直接结合于靶基因hTERT 3'UTR抑制hTERT蛋白表达。miR-138可能成为基于miRNA的肿瘤基因治疗的新靶标。 展开更多

关键词 胃肿瘤 微RNAS 端粒 RNA指导的DNA聚合酶 萤光素酶类 逆转录聚合酶链反应 基因表达

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利用合适的启动子提高外源基因在Jurkat细胞中的表达

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作者 袁娟 牟宗春 +1 位作者 游佳 马维骏 《中国医药生物技术》 CSCD 2012年第4期281-285,共5页

目的通过选择合适的启动子来实现外源基因在Jurkat细胞中的高效表达。方法以pGL3-MCS质粒为基础构建不同启动子(SV40、CMV、EF1α和UbC)驱动萤火虫荧光素酶Fluc报告基因表达的重组质粒,并将其与作为内参的表达海肾荧光素酶Rluc报告基因... 目的通过选择合适的启动子来实现外源基因在Jurkat细胞中的高效表达。方法以pGL3-MCS质粒为基础构建不同启动子(SV40、CMV、EF1α和UbC)驱动萤火虫荧光素酶Fluc报告基因表达的重组质粒,并将其与作为内参的表达海肾荧光素酶Rluc报告基因的质粒共转Jurkat细胞,检测Jurkat细胞中这两种荧光素酶与相应底物反应所产生的荧光强度,计算Fluc与Rluc荧光强度的比值即Fluc的相对酶活,通过比较Fluc相对酶活的大小来选取在Jurkat细胞中具有高表达活性的启动子。结果以pGL3-MCS质粒为基础成功构建了不同启动子驱动Fluc报告基因表达的重组质粒pGL3-CMV、pGL3-EF1α和pGL3-UbC。在Jurkat细胞中,不同启动了驱动的Fluc报告基因的相对酶活的强弱关系为pGL3-UbC>pGL3-EF1α>pGL3-CMV>pGL3-MCS。结论可以选择高活性的人源泛素C启动子实现外源基因在Jurkat细胞中的高效表达,以利于Jurkat细胞系在哺乳动物T淋巴细胞以及免疫相关功能研究中的应用。 展开更多

关键词 JURKAT细胞 启动区(遗传学) 基因报告 萤光素酶类

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小鼠核结合因子a1基因启动子报告载体的构建及鉴定

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作者 郑纺 崔壮 +1 位作者 王宝利 王洪武 《天津医药》 CAS 北大核心 2011年第12期1133-1135,共3页

目的:构建小鼠核结合因子a1(Cbfa1)基因启动子萤光素酶报告载体,并检测其驱动报告基因的转录活性。方法:以小鼠基因组DNA为模板,巢式PCR扩增含有Cbfa1基因启动子(-1000～+200bp)的序列。限制性内切酶MluI和XhoI酶切这段序列后定向克隆... 目的:构建小鼠核结合因子a1(Cbfa1)基因启动子萤光素酶报告载体,并检测其驱动报告基因的转录活性。方法:以小鼠基因组DNA为模板,巢式PCR扩增含有Cbfa1基因启动子(-1000～+200bp)的序列。限制性内切酶MluI和XhoI酶切这段序列后定向克隆到不含启动子的PGL3-Basic报告基因载体上,重组质粒命名为pGL3-Cbfa1。pGL3-Cbfa1瞬时转染成骨细胞系MC3T3-E1,检测其能否在Cbfa1基因启动子的调控下表达报告基因并提高萤光素酶活性。结果:pGL3-Cbfa1经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明Cbfa1启动子具有转录活性,pGL3-Cbfa1的萤光素酶水平约是pGL3-Basic的35倍。结论:小鼠Cbfa1启动子报告基因载体的成功构建,为进一步将其用于抗骨质疏松药物的筛选与评价奠定了实验基础。 展开更多

关键词 基因 报告 萤光素酶类 核心结合因子类 转录启动子

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应用活体成像技术监测联合靶向基因治疗肝癌切除术后复发转移的动物实验研究

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作者 李立新 韩东冬 +3 位作者 寇建涛 李平 马军 贺强 《中华普外科手术学杂志（电子版）》 2010年第4期30-32,共3页

目的应用活体成像技术监测联合靶向基因治疗防止肝癌切除后肿瘤复发或转移的效果。方法采用荧光素酶基因标记的人原发性肝癌细胞株MHCC97-H制备裸鼠人肝癌切除术后肿瘤复发转移模型。20只裸鼠随机分为对照组、联合基因组;各组于肝断面... 目的应用活体成像技术监测联合靶向基因治疗防止肝癌切除后肿瘤复发或转移的效果。方法采用荧光素酶基因标记的人原发性肝癌细胞株MHCC97-H制备裸鼠人肝癌切除术后肿瘤复发转移模型。20只裸鼠随机分为对照组、联合基因组;各组于肝断面、腹膜后组织内分别注射等体积的PBS、2种联合基因rAAV/AFP/IL-24。模型制作后10d、肿瘤切除与基因治疗后21d用活体生物发光法检测肿瘤复发转移的情况。结果建立了稳定高表达荧光素酶基因MHCC97-H的人肝癌细胞株。在原位移植模型的活体成像可检测到生物发光信号。活体生物发光成像法观察到肿瘤复发转移情况:对照组检测到较多的光子数,可见明显肿瘤复发转移;联合基因组的光子数明显少于对照组(P<0.05),显著降低了肿瘤复发转移率。结论采用活体成像技术比其他示踪技术有较大优势,联合靶向基因rAAV/AFP/IL-24可以明显抑制裸鼠肝癌切除术后复发转移。 展开更多

关键词 疾病模型 动物 癌 肝细胞 基因疗法 肿瘤复发 局部 萤光素酶类

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丙型肝炎病毒全长基因嵌合萤光素酶重组质粒转染细胞系的建立与初步应用

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作者 徐洪涛 肖丽 +1 位作者 咸建春 陈亚宝 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期589-592,共4页

目的构建能产生较高效价重组病毒的HCV细胞感染模型，为HCV致病机制的研究和抗病毒药物的筛选提供一个有效的体外细胞培养系统。方法利用PCR技术在HCVNS5AC端插人海肾萤光素酶（Renilla Luciferase，Rluc）报告基因，并引入能提高HCV效... 目的构建能产生较高效价重组病毒的HCV细胞感染模型，为HCV致病机制的研究和抗病毒药物的筛选提供一个有效的体外细胞培养系统。方法利用PCR技术在HCVNS5AC端插人海肾萤光素酶（Renilla Luciferase，Rluc）报告基因，并引入能提高HCV效价的突变，酶切鉴定重组基因序列构建成功后，转染入肝癌细胞系Huh7．5，用细胞免疫荧光、免疫印迹法和萤光素酶活性分析检测病毒复制和感染水平。用IFN“鉴定该系统用于抗丙肝药物筛选的可行性。结果在重组病毒JFH1—2440-RlucRNA转染的细胞中可检测到Rluc的活性，而阴性对照JFH1-GND和野生株JFH1-wtRNA转染的细胞未检测到Rluc的活性，经连续传代，JFH12440-RlucRNA转染细胞所产生的病毒效价可达到1．5×10^4FFU／mL，Rluc的活性随着IFNa浓度的增加而逐渐减低，呈现明显的剂量依赖特性。结论构建的重组HCV-JFH1-Rluc报告基因系统具有经济、快速、敏感等优点，为抗HCV药物的筛选提供了有利平台。 展开更多

关键词 肝炎病毒 丙型 萤光素酶类 基因 报告 细胞 培养的 质粒

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