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RT-PCR检测草鱼呼肠孤病毒的方法研究 被引量：5
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作者 郝贵杰 盛鹏程 +8 位作者 林锋 潘晓艺 徐洋 姚嘉赟 尹文林 曹铮 袁雪梅 蔺凌云 沈锦玉 《集美大学学报（自然科学版）》 CAS 2013年第1期8-13,共6页
草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)为草鱼出血病的病原.本实验根据GenBank中GCRV和其他水生呼肠孤病毒毒株的第六基因片段,在其保守区设计了一对GCRV特异性引物,建立了快速检测GCRV的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法.该PCR体... 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)为草鱼出血病的病原.本实验根据GenBank中GCRV和其他水生呼肠孤病毒毒株的第六基因片段,在其保守区设计了一对GCRV特异性引物,建立了快速检测GCRV的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法.该PCR体系中,上下游引物的最适终浓度为120 nmol/L,最适退火温度为52℃.PCR特异性试验表明:所设计的引物只能扩增GCRV的核酸,而不能扩增嗜水气单胞菌BSK-10、WSSV以及正常CIK细胞的DNA或RNA.敏感性试验表明,当GCRV的反转录模板稀释至5-7时,PCR结果还为阳性.用所建立的RT-PCR方法对5份样品进行检测,结果表明本研究建立的RT-PCR检测方法可靠且可行. 展开更多
关键词 GCRV 草鱼肾细胞系 逆转录聚合酶链式反应 细胞病变效应 快速诊断
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抗菌肽Hepcidin诱导草鱼肾细胞miRNA表达分析
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作者 岳小真 常娇娇 +1 位作者 常新月 李槿年 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1827-1837,共11页
为探讨草鱼抗菌肽Hepcidin(Ci Hep)过表达前后草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)miRNA表达谱变化及其分子机制,将构建的重组表达质粒pmCherry-N1-Cihep转染CIK细胞,通过检测Ci Hep基因转录水平及融合蛋白mCherry-Ci He... 为探讨草鱼抗菌肽Hepcidin(Ci Hep)过表达前后草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)miRNA表达谱变化及其分子机制,将构建的重组表达质粒pmCherry-N1-Cihep转染CIK细胞,通过检测Ci Hep基因转录水平及融合蛋白mCherry-Ci Hep荧光强度,筛选其最佳过表达时间。在最佳过表达时间点收集CIK细胞样本,进一步利用高通量测序和qPCR技术对差异表达miRNA表达谱进行分析。结果显示,Ci Hep基因在CIK细胞中最佳过表达时间为转染后72h。从构建的2个sRNA文库中分别鉴定到1850与2013种已知miRNAs,并发现1266与1347种新miRNAs。与对照组相比,过表达组共筛选到460个DEmiRNAs,其中392个显著上调,68个显著下调。对5150个DEmiRNA靶基因进行GO注释和KEGG通路分析,发现436个靶基因得到GO注释,主要参与细胞进程、生物学调节和单细胞生物进程等生物学过程;157个靶基因富集于54条KEGG通路。miRNA-mRNA-免疫互作网络分析显示,29条DEmiRNA和23个靶基因潜在介导Ci Hep参与C型凝集素受体、PI3K-Akt、NOD样受体等13个免疫相关信号通路。12个DEmiRNAs的qPCR验证结果与高通量测序结果一致。研究解析了Ci Hep过表达前后CIK细胞miRNA差异表达谱特征,明晰pma-miR-199b-5p、dremiR-15a-5p、novel_miR_317和novel_miR_536在免疫调控网络中发挥重要作用,为深入探究鱼类抗菌肽诱导miRNA免疫调节的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 铁调素 过表达 草鱼肾细胞系 MIRNA 差异表达谱
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草鱼孕烷X受体与细胞色素P450 3A mRNA表达相关性初步研究
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作者 符贵红 杨先乐 《海洋渔业》 CSCD 北大核心 2012年第1期76-82,共7页
根据GenBank中斑马鱼(Danio rerio)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)基因序列设计保守区域简并引物,通过PCR扩增获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PXR cDNA核苷酸序列片段为509 bp,经推导获取169 aa序... 根据GenBank中斑马鱼(Danio rerio)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)基因序列设计保守区域简并引物,通过PCR扩增获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PXR cDNA核苷酸序列片段为509 bp,经推导获取169 aa序列。对草鱼与其它物种PXR氨基酸序列进行同源性比较,用以鉴定其在物种中的进化。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测草鱼9种组织PXR和细胞色素P450 3A(cytochrome P450 3A,CYP3A)基因mRNA相对含量,结果表明,其表达丰度依次为:前肠﹥肝脏﹥肾脏﹥鳃﹥肌肉﹥后肠﹥性腺﹥心脏﹥脾脏,CYP3A和PXR基因在草鱼组织中表达分布基本一致,在前肠、肝脏和肾脏高度表达,而在其它组织低度表达。为了进一步研究PXR和CYP3A基因表达相关性,通过细胞,特选用诱导剂利福平(rifampicin,RIF),最佳诱导浓度40μM,孵育1、2、4、6、8、10、12、24 h后,用qRT-PCR检测CYP3A-PXR基因动态表达过程。结果显示,诱导组CYP3A和PXR基因表达量均高于对照组,显示出显著诱导效应。 展开更多
关键词 草鱼 孕烷X受体 细胞色素P450 3A 草鱼肾细胞系
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草鱼细胞系CIK酵母双杂交cDNA文库的构建及初步应用
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作者 闫秀英 谢吉国 +4 位作者 李杰 丁燏 吴灶和 鲁义善 简纪常 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期128-133,共6页
旨在探索草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用,运用SMART技术构建了草鱼肾组织细胞系CIK(Ctenopharyngodon idellus kidney)的酵母双杂交cDNA文库。提取CIK细胞总RNA后,分离纯化mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再... 旨在探索草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用,运用SMART技术构建了草鱼肾组织细胞系CIK(Ctenopharyngodon idellus kidney)的酵母双杂交cDNA文库。提取CIK细胞总RNA后,分离纯化mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母株Y187中构建了草鱼CIK细胞全长cDNA文库。经检测,未扩增文库的转化率为1.6×105,文库容量为2.4×106,插入的双链cDNA片段的长度为250-2 000 bp,文库滴度为7×107 CFU/mL,重组率为98%,此文库具有良好的cDNA片段多态性和完整性。利用构建的CIK酵母双杂交文库,以草鱼呼肠孤病毒的VP7和VP5蛋白作为诱饵进行筛选试验,得到VP7相互作用蛋白的阳性菌落,未得到VP5相互作用蛋白的阳性菌落。草鱼CIK细胞酵母双杂交cDNA文库的构建为研究草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞间的互作机制提供了重要研究工具。 展开更多
关键词 草鱼肾组织细胞系 酵母双杂交 CDNA文库 蛋白质互作
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