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菌落PCR技术在重组质粒筛选与鉴定中的应用 被引量：9
1
作者 李华 刘延琳 +1 位作者 夏惠 张振文 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2004年第9期35-37,共3页
　应用以菌落为模板的聚合酶链反应(PCR)技术,筛选插有酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA和苹果酸通透酶基因mleP序列的重组阳性克隆,筛选到的阳性克隆分别扩增到约1600bp及900bp的条带,且与两个目的基因片段大小一致。提取阳性克隆的质... 　应用以菌落为模板的聚合酶链反应(PCR)技术,筛选插有酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA和苹果酸通透酶基因mleP序列的重组阳性克隆,筛选到的阳性克隆分别扩增到约1600bp及900bp的条带,且与两个目的基因片段大小一致。提取阳性克隆的质粒进一步进行双酶切(EcoR -Kpn )及质粒PCR鉴定,证明结果正确。菌落PCR技术的应用使重组质粒的筛选和鉴定得以优化和简化。 展开更多
关键词 菌落PCR 重组质粒 苹果酸-乳酸酶基因 苹果酸通透酶基因
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酒酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的测序及分析 被引量：5
2
作者 刘延琳 蒋思欣 +2 位作者 李华 何秀萍 张博润 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2004年第6期29-30,共2页
苹果酸乳酸酶是乳酸菌进行苹果酸乳酸发酵(MLF)的关键酶。以携带酒酒球菌(Oenococcusoeni)优良菌系OenococcusoeniSD2a的苹果酸乳酸酶基因mleA的重组质粒pLmleA作为测序质粒,进行测序分析。测序结果表明,克隆到的mleA基因序列与已报道... 苹果酸乳酸酶是乳酸菌进行苹果酸乳酸发酵(MLF)的关键酶。以携带酒酒球菌(Oenococcusoeni)优良菌系OenococcusoeniSD2a的苹果酸乳酸酶基因mleA的重组质粒pLmleA作为测序质粒,进行测序分析。测序结果表明,克隆到的mleA基因序列与已报道的序列同源性为99%。mleA基因序列中有2个碱基与报道不同,其中1614碱基的改变导致错意突变,编码的氨基酸由报道的Asp变为Glu,这一改变使得原有的BamHI位点不再存在。 展开更多
关键词 酒酒球菌 苹果酸-乳酸酶基因 测序
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mleA基因在酿酒酵母中的整合型表达 被引量：4
3
作者 刘延琳 李华 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期1372-1377,共6页
【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌SD-2a(Oenococcus oeni SD-2a)的苹果酸-乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)同时进行。【方法】克隆Oenococ... 【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌SD-2a(Oenococcus oeni SD-2a)的苹果酸-乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)同时进行。【方法】克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA。进行转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE检测及斑点杂交检测,并对酵母转化子培养上清液进行L-苹果酸及L-乳酸含量的HPLC分析,检测目的基因的功能性表达。【结果】转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定表明获得了阳性转化子;SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了目标蛋白,斑点杂交检测表明目的基因整合到受体菌中。模拟发酵表明mleA基因整合到受体菌中后进行了功能性表达,将培养基中的L-苹果酸转化成L-乳酸,使得培养液中的L-苹果酸含量极显著降低。转化子YS59/pYILmleA在添加5648mg·L-1L-苹果酸和10%葡萄糖的SD/-Ura培养基中培养4d,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量与空载体转化子YS59/YIp5(对照)差异极显著,苹果酸的相对降低率为20.18%～20.85%。供试的转化子L-乳酸生成量为1278～1312mg·L-1,对照未检出乳酸的生成。【结论】中国自主筛选的专利菌种O.oeni SD-2a的mleA基因的整合型表达质粒构建成功并在酿酒酵母中进行了功能性表达。 展开更多
关键词 酒酒球菌 苹果酸-乳酸酶基因 整合重组表达 酿酒酵母
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酒酒球菌的快速特异性PCR鉴定 被引量：3
4
作者 刘延琳 李华 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2006年第6期26-29,共4页
以Oenococcus oeni苹果酸-乳酸酶基因(mleA)为目标基因,设计了1对特异性引物PmleaL/PmleaR进行酒酒球菌的快速鉴定研究。结果表明,直接以O.oeni的菌落为模板,通过引物对PmleaL/PmleaR的PCR扩增,可得到mleA基因的特异性条带;用此特异性... 以Oenococcus oeni苹果酸-乳酸酶基因(mleA)为目标基因,设计了1对特异性引物PmleaL/PmleaR进行酒酒球菌的快速鉴定研究。结果表明,直接以O.oeni的菌落为模板,通过引物对PmleaL/PmleaR的PCR扩增,可得到mleA基因的特异性条带;用此特异性引物进行供试乳酸菌的PCR鉴定,所有O.oeni菌系均得到特异性条带,而供试的其它种类乳酸菌未扩增出目标带。PmleaL/PmleaR可用于O.oeni的快速PCR鉴定。 展开更多
关键词 酒酒球菌 苹果酸-乳酸酶基因 特异引物 快速鉴定
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酒类酒球菌快速特异性PCR鉴定体系的优化 被引量：3
5
作者 王华 金刚 +2 位作者 李翠霞 杜立业 李华 《中国酿造》 CAS 北大核心 2010年第5期152-156,共5页
研究采用目前应用较多的快速鉴定方法-种属特异性PCR技术(species-specific PCR)对酒类酒球菌进行鉴定。比较了不同提取方法所提DNA模板对species-specific PCR扩增结果的影响。尝试通过优化反应体系和反应条件,直接使用菌液和菌落作为... 研究采用目前应用较多的快速鉴定方法-种属特异性PCR技术(species-specific PCR)对酒类酒球菌进行鉴定。比较了不同提取方法所提DNA模板对species-specific PCR扩增结果的影响。尝试通过优化反应体系和反应条件,直接使用菌液和菌落作为模板进行扩增。结果表明,使用优化后的方法提取的DNA不需要纯化就能得到稳定的扩增结果,在优化后的反应体系下,可直接使用菌液或菌落作为模板进行扩增,扩增结果稳定,条带清晰。 展开更多
关键词 酒类酒球菌 种属特异性PCR鉴定 苹果酸-乳酸酶基因 快速鉴定
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Oenococcusoeni苹果酸-乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达 被引量：3
6
作者 刘延琳 蒋思欣 +2 位作者 何秀萍 李华 张博润 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期50-55,共6页
苹果酸-乳酸酶是苹果酸-乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸-乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体,构建了重组表达质... 苹果酸-乳酸酶是苹果酸-乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸-乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体,构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母YS58。酵母转化子用SD/Ura平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中,SDSPAGE检测表明获得的转化子表达了约60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了L苹果酸的培养基中培养4d;取培养液上清用HPLC检测L苹果酸及L乳酸含量,采用t检验进行差异显著性分析,结果表明mleA基因进行了功能性的表达,将L苹果酸转化成L乳酸,L苹果酸和L乳酸含量分别与对照差异极显著和显著,苹果酸的相对降低率平均为20.95%。在有选择压力条件下,重组质粒相对稳定,而在无选择压力条件下,传代培养10d后大约有65%的重组质粒丢失。 展开更多
关键词 酒酒球菌 苹果酸-乳酸酶基因 转化表达
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酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA的克隆 被引量：3
7
作者 刘延琳 蒋思欣 +2 位作者 何秀萍 李华 张博润 《农业工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2004年第z1期44-46,共3页
苹果酸-乳酸酶是进行MLF的关键酶.该研究以酒类酒球菌31DH(Oenococcus oeni 31DH)的基因组DNA为模板进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA的PCR扩增.PCR引物为5'-CGGAATTCATGACAGATC-CAGTAAGTAT-3'和5'-TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAA... 苹果酸-乳酸酶是进行MLF的关键酶.该研究以酒类酒球菌31DH(Oenococcus oeni 31DH)的基因组DNA为模板进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA的PCR扩增.PCR引物为5'-CGGAATTCATGACAGATC-CAGTAAGTAT-3'和5'-TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT-3',引物的5端分别引入EcoRI和KpnI酶切位点.得到的PCR产物约1.6kb.PCR产物回收后用EcoRI-KpnI双酶切,与经同样双酶切的质粒YEp352(大肠杆菌-酵母穿梭载体)进行连接并转化大肠杆菌感受态细胞,筛选重组质粒并用酶切及PCR验证.获得的酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的重组质粒命名为pLmleA. 展开更多
关键词 酒类酒球菌 苹果酸-乳酸酶基因 克隆
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酒类酒球菌苹果酸乳酸酶基因的克隆 被引量：1
8
作者 张春晖 夏双梅 刘天明 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2003年第3期21-23,共3页
利用PCR方法从酒类酒球菌 (Oenococcusoeni)基因组中扩增出 6 5 1bp的DNA片段 ,将之克隆到pUC19 T载体上并转化大肠杆菌 (E .coli)JM10 9菌株。重组质粒的测序结果表明 ,克隆到了苹果酸 乳酸酶基因 (mle) ,它含有 5 2 7bp的阅读框架 ,... 利用PCR方法从酒类酒球菌 (Oenococcusoeni)基因组中扩增出 6 5 1bp的DNA片段 ,将之克隆到pUC19 T载体上并转化大肠杆菌 (E .coli)JM10 9菌株。重组质粒的测序结果表明 ,克隆到了苹果酸 乳酸酶基因 (mle) ,它含有 5 2 7bp的阅读框架 ,其核苷酸序列与文献报道相同。 展开更多
关键词 酒类酒球菌 基因克隆 苹果酸-乳酸酶基因(mle)
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苹果酸—乳酸酶基因的研究进展
9
作者 董华 刘天明 吴克学 《农产品加工（下）》 2005年第8期22-23,共2页
近年来,随着分子生物学技术的飞速发展和对苹果酸-乳酸酶(MLE)基因的深入研究,使得苹果酸-乳酸工程菌的构建成为可能。简要阐述了国内外对MLE最新的研究进展。
关键词 苹果酸-乳酸酶基因(MLE) 发酵 克隆
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乳酸乳球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆
10
作者 董华 刘天明 吴克学 《生物技术通报》 CAS CSCD 2006年第5期94-96,共3页
用酚抽提的方法提取乳酸乳球菌的基因组DNA,利用PCR方法从乳酸菌的基因组DNA中扩增出含有苹果酸-乳酸酶基因(malolactic enzyme gene,mle)的约1.6kb的DNA片断,用1%的琼脂糖凝胶分离扩增的片断,用试剂盒回收目的基因。将回收的目的基因与... 用酚抽提的方法提取乳酸乳球菌的基因组DNA,利用PCR方法从乳酸菌的基因组DNA中扩增出含有苹果酸-乳酸酶基因(malolactic enzyme gene,mle)的约1.6kb的DNA片断,用1%的琼脂糖凝胶分离扩增的片断,用试剂盒回收目的基因。将回收的目的基因与pGEM-T载体连接构建mle-T载体并转化大肠杆菌DH5a,挑取阳性克隆(白色菌落),酶切鉴定并测序。SalI酶切mle-T,回收mle DNA片断,与表达载体pET-28a载体连接,构建细菌Escherichia coli表达载体。 展开更多
关键词 苹果酸-乳酸酶基因(mle) 克隆 PCR 测序
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