目的:建立融解曲线法和变性高效液相色谱(DHPLC)法准确、快速地鉴定苯丙酮尿症(PKU)模型小鼠的基因型。方法:融解曲线法采用聚合酶链反应(PCR)扩增包含模型小鼠pah基因点突变位点序列的132bp片段,将该产物予Alw26I酶切后,加入微量SYBR G...目的:建立融解曲线法和变性高效液相色谱(DHPLC)法准确、快速地鉴定苯丙酮尿症(PKU)模型小鼠的基因型。方法:融解曲线法采用聚合酶链反应(PCR)扩增包含模型小鼠pah基因点突变位点序列的132bp片段,将该产物予Alw26I酶切后,加入微量SYBR Green I,在实时PCR仪上行融解曲线分析,同时,酶切产物行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。DHPLC法是直接将132bp片段扩增产物采用在部分变性条件下(60.9℃)行DHPLC分析,根据不同图谱作出基因型诊断。结果:融解曲线分析表明,野生型小鼠的DNA片段在84℃和81℃出现2个融解峰,突变纯合型小鼠DNA片段在76.5～77.5℃和81℃出现2个融解峰,杂合型小鼠DNA片段则在84℃、81℃和76.5～77.5℃均出现融解峰,3种峰型明显可被区分。DHPLC优化了最佳分离效果的柱温,在优化的最佳条件下,DHPLC图谱显示杂合型小鼠DNA具有显著特色的峰型,即除同源双链峰外,出现一个异源双链峰。上述2种新方法共检测了PKU模型小鼠突变纯合型20只、杂合型22只,野生型11只,2种方法检测结果一致,并且与经典的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法结果一致(动物毛色等表型也完全一致)。结论:融解曲线法和DHPLC法均能准确、快速地鉴定模型小鼠的基因型,具有自动化、高通量等优点。展开更多
文摘目的:建立融解曲线法和变性高效液相色谱(DHPLC)法准确、快速地鉴定苯丙酮尿症(PKU)模型小鼠的基因型。方法:融解曲线法采用聚合酶链反应(PCR)扩增包含模型小鼠pah基因点突变位点序列的132bp片段,将该产物予Alw26I酶切后,加入微量SYBR Green I,在实时PCR仪上行融解曲线分析,同时,酶切产物行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。DHPLC法是直接将132bp片段扩增产物采用在部分变性条件下(60.9℃)行DHPLC分析,根据不同图谱作出基因型诊断。结果:融解曲线分析表明,野生型小鼠的DNA片段在84℃和81℃出现2个融解峰,突变纯合型小鼠DNA片段在76.5～77.5℃和81℃出现2个融解峰,杂合型小鼠DNA片段则在84℃、81℃和76.5～77.5℃均出现融解峰,3种峰型明显可被区分。DHPLC优化了最佳分离效果的柱温,在优化的最佳条件下,DHPLC图谱显示杂合型小鼠DNA具有显著特色的峰型,即除同源双链峰外,出现一个异源双链峰。上述2种新方法共检测了PKU模型小鼠突变纯合型20只、杂合型22只,野生型11只,2种方法检测结果一致,并且与经典的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法结果一致(动物毛色等表型也完全一致)。结论:融解曲线法和DHPLC法均能准确、快速地鉴定模型小鼠的基因型,具有自动化、高通量等优点。
