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一种优化小鼠成纤维细胞中自噬小体示踪的方法 被引量：1
1
作者 杨侃 李晓宁 +3 位作者 OmaribaGideon 李凯 周宇荀 肖君华 《中国组织化学与细胞化学杂志》 CAS CSCD 2017年第1期65-71,共7页
目的为了提高对自噬小体示踪的精确度和清晰度,全面展示细胞自噬相关进程,优化基于绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3β(GFP-LC3β)标记物的自噬小体示踪方法。方法组织块贴壁法原代培养小鼠耳成纤维细胞,脂质体转染过表达GFP-LC3β;GFP-... 目的为了提高对自噬小体示踪的精确度和清晰度,全面展示细胞自噬相关进程,优化基于绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3β(GFP-LC3β)标记物的自噬小体示踪方法。方法组织块贴壁法原代培养小鼠耳成纤维细胞,脂质体转染过表达GFP-LC3β;GFP-LC3β充分表达后给予药物刺激以激活或阻断细胞自噬通路,然后进行免疫荧光染色。对染色操作进行优化:首先,延长多聚甲醛的固定细胞时间(从15min延长至45min);其次,提高Triton X-100处理时间,除第一次和最后一次使用PBS润洗,其余每一次使用的PBS都添加0.2%Triton X-100;最后,提升抗体稀释液中BSA和Triton X-100含量,BSA从3%提升至5%,TritonX-100的含量从0.1%提升至0.2%。结果拍照后统计自噬小体发现,新方法更加准确地标记GFP-LC3β指示物,自噬激活条件下示踪准确度显著提升(达4.2倍);新方法更加清晰地呈现自噬小体的形态和胞内分布,将自噬小体示踪的清晰度显著提升(达2.5倍);新方法还能使用不同荧光通道,同时标记其他自噬相关基因。结论本研究提供的一种优化小鼠成纤维细胞中自噬小体示踪的方法将为全面展示细胞自噬进程、深入了解细胞自噬相关机制提供有力的技术支持。 展开更多
关键词 细胞自噬 绿色荧光蛋白-小鼠微管相关蛋白1轻链3β 自噬小体示踪 原代培养
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