结核分枝杆菌肝素结合血凝素在结核病免疫应答中的研究 被引量：3

1

作者 聂理会 孙照刚 +3 位作者 张旭霞 刘毅 高孟秋 李传友 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期792-795,共4页

目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）的免疫应答作用及其在结核病诊断中的应用价值。方法选取PPD（-）健康对照、PPD（＋）潜伏感染者、肺结核患者，分离外周血单个核细胞，用天然HBHA刺激，培养4d后收集细胞培养上清，EHSA方... 目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）的免疫应答作用及其在结核病诊断中的应用价值。方法选取PPD（-）健康对照、PPD（＋）潜伏感染者、肺结核患者，分离外周血单个核细胞，用天然HBHA刺激，培养4d后收集细胞培养上清，EHSA方法检测上清中的IFN-γ。同时用EHSA方法检测各组血清中的HBHA特异的IgG型抗体。结果HBHA刺激后3组产生的IFN—γ中位数分别为49．5pg/ml、781．9pg／ml、341．8pg／ml，潜伏感染者产生的IFN-γ水平远高于健康对照，略高于肺结核患者。三组血清抗HBHA的IgG抗体浓度吸光度（A）的均值分别为0．212±0．066、0．224±0．076和0．285±0．078。肺结核患者的HBHA特异的IgG抗体远高于健康对照及潜伏感染者。结论HBHA有较好的免疫原性，可以刺激潜伏感染者产生高水平的IFN-γ，HBHA特异的IFN-γ释放反应有利于鉴别潜伏感染者。HBHA的抗体水平在结核病的诊断中有一定的辅助应用价值。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 肝素结合血凝素 IFN-Γ 体液免疫

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分枝杆菌肝素结合血凝素研究进展 被引量：1

2

作者 陈玉兰 刘一朵 周向梅 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2022年第1期95-101,共7页

结核病是由分枝杆菌感染引起的世界范围内流行的人畜共患病。肝素结合血凝素(heparin-binding adhesin,HBHA)是分枝杆菌表达的一种蛋白质,致病性分枝杆菌的HBHA蛋白具有黏附上皮细胞、扩散感染范围等功能。其发挥黏附功能的C端结构域能... 结核病是由分枝杆菌感染引起的世界范围内流行的人畜共患病。肝素结合血凝素(heparin-binding adhesin,HBHA)是分枝杆菌表达的一种蛋白质,致病性分枝杆菌的HBHA蛋白具有黏附上皮细胞、扩散感染范围等功能。其发挥黏附功能的C端结构域能够刺激机体产生有效的Th1细胞免疫反应;HBHA特异的黏膜免疫反应能够提供一定的保护效果。这提示HBHA具有制作为疫苗的潜力。而且,HBHA蛋白在活动性结核病患者和潜伏感染者中引发的免疫反应存在差异,这使其可以成为新的诊断抗原。此外,在细胞水平上,HBHA可以利用补体系统进入巨噬细胞,促使巨噬细胞向M1极化,同时能够逃避自噬并诱发线粒体损伤和内质网应激介导功能,这为结核病的致病机制提供了更多的解释。HBHA与宿主之间相互作用认识的积累,可以为HBHA的应用性研究提供依据。 展开更多

关键词 分枝杆菌属 肝素结合血凝素 抗原 研究

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疫苗候选抗原HBHA通过诱导IL-17发挥抗结核免疫保护效应 被引量：1

3

作者 蔡铮 黄嫄 +4 位作者 唐锦华 张瑞 陈健康 王晶 马越云 《中华预防医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期370-376,共7页

为探讨疫苗候选抗原—结核分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)通过黏膜接种诱导的保护性免疫效应。动物实验均使用6~8周龄雌性C57BL/6小鼠。30只小鼠接受不同的免疫接种策略,采用随机数字表法分为对照组、早期分泌抗原靶蛋白-6(ESAT-6)滴鼻组... 为探讨疫苗候选抗原—结核分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)通过黏膜接种诱导的保护性免疫效应。动物实验均使用6~8周龄雌性C57BL/6小鼠。30只小鼠接受不同的免疫接种策略,采用随机数字表法分为对照组、早期分泌抗原靶蛋白-6(ESAT-6)滴鼻组、HBHA滴鼻组、BCG初免PBS对照组、BCG初免HBHA加强组,每组6只。通过检测免疫后小鼠血浆白细胞介素17A(IL-17A)等细胞因子水平;肺IL-17A mRNA相对表达量(RQ);肺三级淋巴结构的形成,及与其形成相关的趋化因子的检测;脾Th1、Th17细胞比例比较,从而分析免疫效应。BCG初免PBS对照组和BCG初免HBHA加强组(每组各30只小鼠),用BCG滴鼻模拟感染。在感染后预设的时间点做肺组织菌落计数,以评估细菌清除效率。多组间比较采用单因素方差分析,事后分析采用LSD检验;两组间比较采用独立样本t检验。结果显示,免疫后的小鼠血浆细胞因子IL-17A水平和肺IL-17A mRNA相对表达量,在BCG初免HBHA加强组[(14.76±4.73)pg/mL,RQ为(12.27±6.71)]中最高,比对照组[(5.57±2.95)pg/mL,RQ为(1.30±0.97)]明显升高(t=4.213,P<0.001;t=5.984,P<0.001),也显著高于BCG初免PBS对照组[(6.81±2.18)pg/mL,RQ为(1.44±1.16)](t=3.646 P=0.001;t=6.185 P<0.001)。脾脏Th17细胞比例,与BCG初免PBS对照组(0.38±0.38)%比较,BCG初免HBHA加强组(1.02±0.34)%显著增高(t=-0.280,P=0.048),该组在肺部诱导形成了三级淋巴结构,并在感染的早期降低了肺细菌负荷。综上,HBHA通过黏膜递送可有效增强BCG接种后的免疫保护效应,可能是一种有潜力的候选疫苗组分。 展开更多

关键词 结核 疫苗 白细胞介素17 肝素结合血凝素 TH17细胞 三级淋巴结构

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结核分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)的研究进展 被引量：1

4

作者 梁海燕 袁俐 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1040-1043,共4页

肝素结合血凝素(HBHA)是结核分枝杆菌的一种表面蛋白,拥有3个功能结构域,其中碳末端在翻译后进行甲基化修饰,这与其免疫学特性有关。它不仅与细菌的黏附作用相关,可通过补体C3介导与巨噬细胞的结合,还通过与上皮细胞结合,在肺外播散型... 肝素结合血凝素(HBHA)是结核分枝杆菌的一种表面蛋白,拥有3个功能结构域,其中碳末端在翻译后进行甲基化修饰,这与其免疫学特性有关。它不仅与细菌的黏附作用相关,可通过补体C3介导与巨噬细胞的结合,还通过与上皮细胞结合,在肺外播散型结核的发生中发挥重要功能,另外在抗肿瘤免疫中也有一定的作用;也可以作为新一代的血清学诊断标识,鉴别诊断活动性与非活动性结核病,并在开发结核新疫苗及抗结核病新药中显示出潜在应用价值。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 肝素结合血凝素 疫苗

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表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力 被引量：1

5

作者 赵善民 赵勇 +5 位作者 张彩勤 毛峰峰 白冰 张海 师长宏 徐志凯 《生物技术通讯》 CAS 2012年第3期383-385,共3页

目的:测定表达肝素结合血凝素(HBHA)和人白细胞介素12(hIL-12)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导产生的免疫应答及对结核分枝杆菌感染的保护作用。方法:将表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌采用同源加强免疫的方法免... 目的:测定表达肝素结合血凝素(HBHA)和人白细胞介素12(hIL-12)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导产生的免疫应答及对结核分枝杆菌感染的保护作用。方法:将表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌采用同源加强免疫的方法免疫小鼠,检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2和IL-12的表达水平;用结核分枝杆菌感染免疫小鼠,检测小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。结果:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠产生以IFN-γ、IL-2分泌量增加为主的Th1型免疫应答,并能有效减少感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量和病理损伤。结论:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠可诱导产生与卡介苗相当的保护作用,可能成为控制结核病的有效疫苗。 展开更多

关键词 耻垢分枝杆菌 肝素结合血凝素 人白细胞介素12 保护力

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结核分枝杆菌肝素结合血凝素与纯蛋白衍化物的细胞免疫作用比较 被引量：1

6

作者 聂理会 孙照刚 +3 位作者 张旭霞 刘毅 高孟秋 李传友 《国际呼吸杂志》 2009年第12期713-716,共4页

目的通过结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）与纯蛋白衍化物（PPD）的免疫作用比较，探讨HBHA的免疫保护作用及诊断应用价值。方法选取阴性对照者、潜伏感染者、肺结核患者，分离人选者的外周血单个核细胞，分为无刺激、HBHA、PPD刺激... 目的通过结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）与纯蛋白衍化物（PPD）的免疫作用比较，探讨HBHA的免疫保护作用及诊断应用价值。方法选取阴性对照者、潜伏感染者、肺结核患者，分离人选者的外周血单个核细胞，分为无刺激、HBHA、PPD刺激组，培养4d后收集细胞培养上清，ELISA方法检测上清中的γ-干扰素（IFN-γ）和白介素4。结果HBHA刺激后3组产生的IFN-γ中位数分别为49．5ng／L、781．9ng／L、341．8ng／L，潜伏感染者产生的IFN-γ水平远高于阴性对照者，略高于肺结核患者，HBHA特异的IFN-γ在不同治疗时间肺结核之间有显著差异。结论HBHA有较好的免疫原性，可以刺激潜伏感染者产生高水平的1FN-γ，潜伏感染者未发展为活动性结核病可能与HBHA的免疫保护作用有关，HBHA特异的IFN-γ释放反应有利于鉴别潜伏感染者。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 肝素结合血凝素 Γ-干扰素

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结核分枝杆菌肝素结合血凝素对巨噬细胞极化的影响 被引量：1

7

作者 范琳琳 郑青 +5 位作者 杨柳 周磊 李蕊 常亮 郝晓柯 马越云 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期915-920,共6页

目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）对小鼠骨髓来源巨噬细胞和小鼠巨噬细胞系Raw264．7细胞极化的影响。方法在应用免疫荧光法确认HBHA进入巨噬细胞的基础上，对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）和Raw264．7细胞分别施加LPs（100n... 目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）对小鼠骨髓来源巨噬细胞和小鼠巨噬细胞系Raw264．7细胞极化的影响。方法在应用免疫荧光法确认HBHA进入巨噬细胞的基础上，对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）和Raw264．7细胞分别施加LPs（100ng/m1）＋IFN-γ（2．5ng／ml）、IL4（20ng/m1）、不同浓度的HBHA（1μg/ml，3μg／ml，6μg／ml，10μg/m1）和ESAT-6（5μg／m1）。以ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α。通过RT-PCR方法检测M1型极化分子标志诱导型一氧化氮合酶（iN0s）和TNF-α等，以及M2型极化分子标志精氨酸酶1（Arg-1）和CD206。最后westernb10t检测细胞iN0s和Arg-1蛋白表达水平。结果结核分枝杆菌HBHA处理BMDM细胞后，培养上清中IL-6、IL-12、TNF-α细胞因子分泌明显增加．iNOS和TNF-α基因表达升高；处理后的Raw264．7细胞中，IL-6分泌量增多，TNF-α表达上调，与EsAT-6对小鼠巨噬细胞的作用结果一致。HBHA和ESAT_6处理小鼠骨髓来源巨噬细胞不能增加M2极化分子标志Arg-1的蛋白表达，但都能诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞和Raw264．7细胞iN0s生成增加。结论结核分枝杆菌HBHA可诱导小鼠巨噬细胞向M1极化。 展开更多

关键词 巨噬细胞 极化 肝素结合血凝素 ESAT-6

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结核分枝杆菌肝素结合血凝素与纯蛋白衍化物的细胞免疫作用比较

8

作者 聂理会 孙照刚 +3 位作者 张旭霞 刘毅 高孟秋 李传友 《结核病与胸部肿瘤》 2009年第3期166-170,共5页

目的通过结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）与纯蛋白衍化物（PPD）的免疫作用比较，探讨HBHA的免疫保护作用及诊断应用价值。方法选取阴性对照者、潜伏感染者、肺结核患者，分离入选者的外周血单个核细胞，分为无刺激、HBHA、PPD刺激... 目的通过结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）与纯蛋白衍化物（PPD）的免疫作用比较，探讨HBHA的免疫保护作用及诊断应用价值。方法选取阴性对照者、潜伏感染者、肺结核患者，分离入选者的外周血单个核细胞，分为无刺激、HBHA、PPD刺激组，培养4d后收集细胞培养上清，ELISA方法检测上清中的γ-干扰素（IFN-γ）和白介素4（IL-4）。结果HBHA刺激后3组产生的IFN—γ中位数分别为：49．5ng／ml、781．9ng／ml、341．8ng/ml，潜伏感染者产生的IFN-γ水平远高于阴性对照组，略高于肺结核组，HBHA特异的IFN-γ在不同治疗时间肺结核之间有显著差异。结论HBHA有较好的免疫原性，可以刺激潜伏感染者产生高水平的IFN-γ，潜伏感染者未发展为活动性结核病可能与HBHA的免疫保护作用有关，HBHA特异的IFN-γ释放反应有利于鉴别潜伏感染者。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 肝素结合血凝素 Γ-干扰素

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肝素结合血凝素通过抑制A549细胞的自噬作用增强耻垢分枝杆菌的感染能力

9

作者 郑青 杨柳 +5 位作者 杨静 周珊 周磊 韩若冰 郝晓柯 马越云 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期696-699,703,共5页

目的将肝素结合血凝素(HBHA)重组表达于耻垢分枝杆菌(MS),鉴定其对A549细胞自噬作用的影响。方法将HBHA克隆于穿梭表达质粒pMV261,构建HBHA重组载体,电转化至MS;感染A549细胞,Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情... 目的将肝素结合血凝素(HBHA)重组表达于耻垢分枝杆菌(MS),鉴定其对A549细胞自噬作用的影响。方法将HBHA克隆于穿梭表达质粒pMV261,构建HBHA重组载体,电转化至MS;感染A549细胞,Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,并检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化可估计自噬的水平;利用单丹磺酰尸胺(MDC)将自噬体染色后,激光共聚焦观察细胞内自噬体变化的情况;通过MS、rMS-HBHA感染A549细胞18 h,计算胞内活菌数,鉴定感染状况。结果 rMS-HBHA经42℃热诱导成功表达HBHA蛋白;相对野生型MS,重组表达HBHA蛋白的MS(rMS-HBHA)可以显著抑制A549细胞中的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表达,rMS-HBHA组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值为0.625显著低于MS组2.025,表明rMS-HBHA组自噬体形成受到抑制;并且rMS-HBHA感染A549细胞18 h后胞内活菌为6.3×106,明显高于MS组1×105。结论外源性HBHA可以通过抑制A549细胞的自噬作用增强MS的感染能力。 展开更多

关键词 RMS 肝素结合血凝素 A549细胞 LC3 耻垢分枝杆菌

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结核分枝杆菌肝素结合血凝素在结核病免疫应答中的研究

10

作者 聂理会 孙照刚 +3 位作者 张旭霞 刘毅 高孟秋 李传友 《结核病与胸部肿瘤》 2010年第1期20-24,共5页

目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素的免疫应答作用及其在结核病诊断中的应用价值。方法选取PPD（-）的健康对照、PPD（＋）的潜伏感染者、肺结核患者，分离入选者的外周血单个核细胞，用天然HBHA刺激，培养4天后收集细胞培养上清，EL... 目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素的免疫应答作用及其在结核病诊断中的应用价值。方法选取PPD（-）的健康对照、PPD（＋）的潜伏感染者、肺结核患者，分离入选者的外周血单个核细胞，用天然HBHA刺激，培养4天后收集细胞培养上清，ELISA方法检测上清中的γ-干扰素（IFN-γ）。同时用ELISA方法检测各组血清中的HBHA特异的IgG型抗体。结果HBFIA刺激后三组产生的IFN—γ中位数分别为：49．5pg／ml、781．9pg／ml、341．8pg／ml，潜伏感染者产生的IFN-γ水平远高于健康对照，略高于肺结核。三组血清IgG抗体浓度吸光度的均值分别为0．212±0．066，0．224±0．076，0．285±0．078。肺结核患者的HBHA特异的IgG抗体远高于健康对照及潜伏感染者。结论HBHA有较好的免疫原性，HBHA特异的IFN—γ释放反应有利于鉴别潜伏感染者。HBHA的抗体水平在结核病的诊断中有一定的辅助应用价值。 展开更多

关键词 肝素结合血凝素 分枝杆菌 结核 Γ-干扰素 体液免疫

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结核分枝杆菌肝素结合血凝素对结核性胸膜炎诊断、鉴别诊断的临床观察 被引量：9

11

作者 聂理会 任卫聪 +1 位作者 王敬 李传友 《中国临床医生杂志》 2013年第3期27-28,共2页

目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素对结核性胸膜炎诊断、鉴别诊断的价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例为观察组,另选取恶性肿瘤胸膜转移患者40例为对照组,以重组结核分枝杆菌肝素结合血凝素为抗原,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)... 目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素对结核性胸膜炎诊断、鉴别诊断的价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例为观察组,另选取恶性肿瘤胸膜转移患者40例为对照组,以重组结核分枝杆菌肝素结合血凝素为抗原,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测患者胸腔积液中IgG抗体。结果观察组IgG抗体高于对照组,差异有显著性(P<0.05);ROC曲线分析结果显示,胸水中IgG抗体的诊断临界值为0.46时,诊断敏感度为90.7%、特异度为90.0%、准确度为90.4%。结论结核分枝杆菌肝素结合血凝素对结核性胸膜炎的辅助诊断,以及与恶性肿瘤胸膜转移的鉴别诊断具有重要价值。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌肝素结合血凝素 结核性胸膜炎 恶性肿瘤胸膜转移 鉴别诊断

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肝素结合血凝素蛋白在结核病诊断中的应用研究 被引量：1

12

作者 周珊 徐修礼 +4 位作者 马越云 刘家云 樊新 孙怡群 郝晓柯 《检验医学》 CAS 北大核心 2011年第12期806-810,共5页

目的制备天然和重组肝素结合血凝素(HBHA)蛋白,探讨其在结核杆菌感染诊断中的应用价值。方法用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段。结核分枝杆菌HBHA基因克隆至PQE80L克隆表达载体中,序列测定正确后,将其转化到... 目的制备天然和重组肝素结合血凝素(HBHA)蛋白,探讨其在结核杆菌感染诊断中的应用价值。方法用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段。结核分枝杆菌HBHA基因克隆至PQE80L克隆表达载体中,序列测定正确后,将其转化到大肠埃希菌BL-21中,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达HBHA蛋白,表达蛋白经SDS-PAGE及免疫印迹法分析后,亲和层析法纯化蛋白,并以此免疫新西兰兔制备多克隆抗体。同时将7H9液体培养基中的卡介苗(BCG)培养至稳定生长期,用CL-6B层析柱分离纯化HBHA蛋白。观察抗体对不同浓度天然HBHA和重组HBHA诱导BCG聚集效应的影响。结果所得天然和重组HBHA蛋白均有诱导BCG聚集的作用,并均可被多克隆抗体抑制。结论成功获得天然HBHA和重组HBHA蛋白;证实了两者均具有促进BCG聚集的功能,并可被由重组HBHA诱导产生的多克隆抗体所抑制。从而为进一步研究HBHA的临床诊断价值提供了实验依据。 展开更多

关键词 肝素结合血凝素蛋白 多克隆抗体 结核分枝杆菌

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牛分支杆菌HBHA基因的克隆及原核表达

13

作者 赵子惠 温峰琴 +1 位作者 项海涛 曾巧英 《动物医学进展》 北大核心 2015年第10期5-9,共5页

应用PCR技术扩增牛分支杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因并原核表达牛分支杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对该基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET28a(+)-HBHA,并转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经0.6mmol/L IPTG... 应用PCR技术扩增牛分支杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因并原核表达牛分支杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对该基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET28a(+)-HBHA,并转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经0.6mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达,采用镍离子亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot检测表达结果。结果表明,牛分支杆菌HBHA基因完整的ORF全长600bp,编码199个氨基酸。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含有12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核及线粒体中,蛋白空间结构以α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠为主。成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HBHA并在大肠埃希菌中得到了高效表达,分子质量大小为28ku,主要以可溶性形式存在。说明牛分支杆菌HBHA蛋白是一种抗原指数较高的亲水性蛋白,在原核系统能高效的表达,为进一步研究提供了理论基础。 展开更多

关键词 牛分支杆菌 肝素结合血凝素基因 生物信息学分析 原核表达

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结核分枝杆菌抗原HBHA在耻垢分枝杆菌中的重组表达和鉴定

14

作者 余菲 寻阳 +5 位作者 田茂鹏 李华秀 朱可橙 袁野 滕新栋 范雄林 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期406-410,共5页

目的构建高效表达结核分枝杆菌抗原肝素结合血凝素(HBHA)的重组耻垢分枝杆菌。方法针对结核分枝杆菌H37Rv株HBHA的编码基因Rv0475设计特异引物,利用PCR技术从细菌基因组中获取目的基因,并克隆入pET-30b(+)载体构建重组原核表达质粒pETHB... 目的构建高效表达结核分枝杆菌抗原肝素结合血凝素(HBHA)的重组耻垢分枝杆菌。方法针对结核分枝杆菌H37Rv株HBHA的编码基因Rv0475设计特异引物,利用PCR技术从细菌基因组中获取目的基因,并克隆入pET-30b(+)载体构建重组原核表达质粒pETHBHA,经IPTG诱导pETHBHA转化的重组E.coli BL21(DE3)细菌,Ni柱纯化携带C-端His标签的HBHA蛋白,并制备鼠源多克隆抗体。PCR扩增含自身启动子和调节序列的Rv0475基因并克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组分枝杆菌表达质粒pMVHBHA,并经酶切鉴定证实后,电转化入耻垢分枝杆菌,涂布含卡那霉素的7H11平板,挑选抗性克隆并扩大培养,15%SDS-PAGE和Western blot鉴定重组耻垢分枝杆菌的表达。结果分别成功构建重组原核表达质粒pETHBHA和重组分枝杆菌表达质粒pMVHBHA;重组蛋白HBHA在大肠埃希菌中成功表达并纯化后,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度为1.912 5μg/μL,用其制备鼠源多抗;证实HBHA利用其自身的启动子和调节序列在重组耻垢分枝杆菌中表达。结论成功构建过表达HBHA的重组耻垢分枝杆菌,为研究该蛋白参与结核病的致病机制和研发新型疫苗和诊断试剂奠定了基础。 展开更多

关键词 肝素结合血凝素(HBHA) 耻垢分枝杆菌 结核病 表达

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