绿色荧光蛋白标记的表达载体pHis-EGFP的构建 被引量：3

1

作者 王伟 孟超 +1 位作者 朱平 程克棣 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第9期35-39,共5页

为对重组蛋白的表达进行直观检测并简化蛋白纯化的步骤,构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体pHis-EGFP。该载体含有源自表达载体pET-32a的T7启动子、终止子和源自质粒pUC18的ColE1复制子与绿色荧光蛋白报告基因。应用该载... 为对重组蛋白的表达进行直观检测并简化蛋白纯化的步骤,构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体pHis-EGFP。该载体含有源自表达载体pET-32a的T7启动子、终止子和源自质粒pUC18的ColE1复制子与绿色荧光蛋白报告基因。应用该载体成功地表达并纯化了酵母GGDP(geranylgeranyldiphosphate,GGDP)合酶融合蛋白,结果表明所构建的载体是一个实用的表达载体,并建立了离子交换层析和亲和层析两步纯化融合蛋白的方法。 展开更多

关键词 表达载体 绿色荧光蛋白(egfp) GGDP合酶 绿色荧光蛋白标记 构建 蛋白纯化 融合蛋白 离子交换层析 T7启动子 PUC18

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EGFP-MAD2融合基因表达载体的构建及功能验证 被引量：1

2

作者 于晓晨 梁剑青 +3 位作者 王嫚娜 牛祖彪 陈昭烈 孙强 《生物技术通讯》 CAS 2018年第3期335-339,共5页

目的:构建绿色荧光蛋白(EGFP)与有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2)融合基因表达载体,并初步验证融合基因的功能。方法:采用PCR技术扩增EGFP-MAD2融合基因,连接入T载体进行序列测定,随后克隆入逆转录表达载体p QCXIP-EGFP-N1获得重组质粒,采... 目的:构建绿色荧光蛋白(EGFP)与有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2)融合基因表达载体,并初步验证融合基因的功能。方法:采用PCR技术扩增EGFP-MAD2融合基因,连接入T载体进行序列测定,随后克隆入逆转录表达载体p QCXIP-EGFP-N1获得重组质粒,采用脂质体转染293FT细胞,荧光显微镜观察融合蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞周期。结果:获得序列正确的EGFP-MAD2融合基因及其表达载体p QCXIP-EGFP-MAD2;EGFP-MAD2基因可在293FT细胞中表达;流式分析显示EGFP-MAD2表达的细胞G2/M期比例增加。结论:构建了EGFP-MAD2融合基因表达载体,EGFP-MAD2融合蛋白的表达可以诱导细胞发生G2/M期阻滞。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白(egfp) 有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2) 融合基因 细胞周期阻滞

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抗HCV复制调控区药物体外筛选模型的建立

3

作者 王玉梅 梁璐 +1 位作者 叶蕴华 周亚伟 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1796-1801,共6页

目的:建立抗丙型肝炎病毒(HCV)复制调控区体外药物筛选模型。方法:将全长HCV的5'非翻译区(5'UTR)的cDNA克隆至启动子探测载体pEGFP-1,构建重组载体p5'NCR-EGFP,并转染至人肝癌细胞系HepG2。获得的转染细胞以荧光显微镜检测... 目的:建立抗丙型肝炎病毒(HCV)复制调控区体外药物筛选模型。方法:将全长HCV的5'非翻译区(5'UTR)的cDNA克隆至启动子探测载体pEGFP-1,构建重组载体p5'NCR-EGFP,并转染至人肝癌细胞系HepG2。获得的转染细胞以荧光显微镜检测及原位杂交法验证,并经流式细胞术分选。通过干扰素与利巴韦林2种常规抗病毒药物对所构建的模型进行初步应用。结果:荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白(EGFP)的强表达,原位杂交检测到转染细胞的核区有特异性杂交信号。流式细胞术可检测到表达EGFP的阳性细胞达95%以上。初步运用结果显示,γ干扰素对该模型有明显的抑制作用,而利巴韦林及α-2b干扰素在本模型上的抑制作用较弱。结论:该细胞模型经验证可以成为体外筛选抗HCV复制调控区药物的模型。 展开更多

关键词 抗丙型肝炎病毒(HCV)药物 药物筛选模型 5'非翻译区 cDNA克隆 转染细胞 抗病毒药物 干扰素 利巴韦林 荧光显微镜检测 原位杂交法 绿色荧光蛋白(egfp)

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pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化 被引量：19

4

作者 董晓 王家宁 +1 位作者 黄永章 郭凌郧 《郧阳医学院学报》 2005年第6期321-325,F0003,共6页

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性... 目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 TA克隆载体 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 重组质粒 蛋白表达 蛋白纯化

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增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建 被引量：8

5

作者 徐洁杰 张伟娟 +1 位作者 王浩明 胡火珍 《四川大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期386-388,共3页

构建增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3.1(+) EGFP,转染至培养的Hela细胞中成功表达,并发出绿色荧光,证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记.

关键词 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 真核表达载体 转染 HELA细胞

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大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)增强型绿色荧光蛋白遗传转化载体的构建 被引量：6

6

作者 宋传玲 李丽珺 文景芝 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期9-12,共4页

载体的构建是建立遗传转化体系的基础。以真核表达载体pcDNA3.1(-)/hygro为基本骨架,构建大豆疫霉菌遗传转化载体,通过限制性内切酶酶切、去磷酸化、连接等基因重组技术,将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP... 载体的构建是建立遗传转化体系的基础。以真核表达载体pcDNA3.1(-)/hygro为基本骨架,构建大豆疫霉菌遗传转化载体,通过限制性内切酶酶切、去磷酸化、连接等基因重组技术,将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)基因和来自莴苣霜霉菌(Bremia lactucae)的启动子(ham34)、终止子重组到真核表达载体pcDNA3.1(-)/hygro中,经大肠杆菌转化后对转化子进行了酶切验证,为大豆疫霉菌遗传转化体系的建立提供载体。 展开更多

关键词 大豆疫霉菌(Phytophthora sojae) 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 载体构建

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巴西固氮螺菌Yu62的EGFP标记及其在小麦体内的定殖研究 被引量：5

7

作者 刘华伟 王庆贺 +3 位作者 张宏 王蕊 肖红利 郭蔼光 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期2367-2372,共6页

以质粒pEGFP-C1为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因全长序列,将其与原核表达载体pVK-100连接,构建成重组载体pVK-EGFP。利用电转化法将重组载体导入巴西固氮螺菌Yu62中,得到EGFP标记菌株。用EGFP标记菌接种小麦... 以质粒pEGFP-C1为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因全长序列,将其与原核表达载体pVK-100连接,构建成重组载体pVK-EGFP。利用电转化法将重组载体导入巴西固氮螺菌Yu62中,得到EGFP标记菌株。用EGFP标记菌接种小麦‘小偃107’种子,室内限菌条件下培养10 d后,用荧光显微镜观测标记菌在小麦体内的定殖规律并观察接菌植株的田间生长状况。结果显示,巴西固氮螺菌Yu62能定殖于小麦根毛区、茎组织的细胞间隙等部位,而且接菌小麦‘小偃107’植株在根系发育、株高、分蘖数等方面比对照有较明显的优势。研究表明,巴西固氮螺菌Yu62能够定殖于小麦根茎内,并具有促进植物生长的作用。 展开更多

关键词 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 巴西固氮螺菌YU62 小麦 定殖

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子宫内膜细胞诱导胚胎干细胞修复小鼠受损子宫内膜 被引量：4

8

作者 曲军英 王燕华 +2 位作者 吕一帆 潘琳 江一平 《生殖与避孕》 CAS CSCD 2013年第10期647-651,共5页

目的：探讨小鼠胚胎干细胞（ESCs）经体外与子宫内膜细胞共培养后移植于内膜损伤小鼠的子宫腔是否有助于损伤的修复并降低其成瘤性。方法：制备新鲜子宫内膜损伤的小鼠模型，利用带EGFP基因标记的小鼠胚胎干细胞（ESC-EGFP）与同种子宫... 目的：探讨小鼠胚胎干细胞（ESCs）经体外与子宫内膜细胞共培养后移植于内膜损伤小鼠的子宫腔是否有助于损伤的修复并降低其成瘤性。方法：制备新鲜子宫内膜损伤的小鼠模型，利用带EGFP基因标记的小鼠胚胎干细胞（ESC-EGFP）与同种子宫内膜共培养后移植至模型鼠宫腔；观察ESC-EGFP在模型鼠宫腔内滞留情况、对损伤内膜的修复影响以及对干细胞移植后成瘤性的影响。结果：将与子宫内膜共培养后的ESC-EGFP移植到新鲜损伤的模型鼠宫腔内，可使损伤子宫的外形较PBS对照组保持更好，移植后1-4周的损伤子宫大体标本均可见荧光；组织病理可见新生子宫内膜腺体样组织，并显示GFP免疫组织化学标记；且在有限观察时间内无肿瘤形成。结论：ESCs与子宫内膜细胞共培养方式可能诱导ESCs分化的方向，而在体子宫腔损伤的局部环境有利于胚胎干细胞定植与进一步向子宫内膜分化。 展开更多

关键词 胚胎干细胞(ESCs) 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 子宫内膜 子宫内膜损伤模型

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促进米黑根毛霉脂肪酶分泌的毕赤酵母内源信号肽的筛选 被引量：4

9

作者 苗杨利 李站胜 韩双艳 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2019年第10期155-163,共9页

米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase,RML)在造纸、食品、化妆品以及医药等行业应用广泛。本研究通过SignalP 4.1在线预测软件预测出9种具有分泌潜力的毕赤酵母内源信号肽序列:FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、F... 米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase,RML)在造纸、食品、化妆品以及医药等行业应用广泛。本研究通过SignalP 4.1在线预测软件预测出9种具有分泌潜力的毕赤酵母内源信号肽序列:FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9。以广泛应用的酿酒酵母α-交配因子(α-mating factor,α-MF)信号肽为对照,考察这九种内源信号肽对增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)和RML在蛋白酶缺陷型PichiaPinkTM表达系统的分泌效果。结果发现FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介导EGFP分泌,且PRY2、DSE4、MSB2、FRE2介导EGFP的分泌水平优于α-MF,分别是α-MF的2.15倍、1.15倍、1.33倍、1.30倍;FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介导RML的分泌,且FLO10介导RML的分泌水平最高,是α-MF的1.50倍,说明内源信号肽FLO10更能有效分泌RML。本研究为提高米黑根毛霉脂肪酶在蛋白酶缺陷型毕赤酵母的表达量奠定了一定的基础。 展开更多

关键词 蛋白酶缺陷型毕赤酵母 信号肽 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 米黑根毛霉脂肪酶(RML)

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黑曲霉尿苷/尿嘧啶营养缺陷型转化系统的构建及应用

10

作者 王小平 宋问 +6 位作者 张霏 刘燕 王升帆 邵东 梁玲玲 许新德 郑建永 《浙江工业大学学报》 北大核心 2024年第1期105-111,共7页

黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的工业发酵菌株,它具有强大的蛋白分泌表达能力。为了提高黑曲霉遗传操作效率及优化重组菌株的筛选策略,构建以尿苷/尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的转化系统。利用CRISPR/Cas9技术实现pyrG基因的敲除... 黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的工业发酵菌株,它具有强大的蛋白分泌表达能力。为了提高黑曲霉遗传操作效率及优化重组菌株的筛选策略,构建以尿苷/尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的转化系统。利用CRISPR/Cas9技术实现pyrG基因的敲除,在含有尿嘧啶核苷和5-氟乳清酸(5-FOA)的抗性培养基中筛选表型正确的转化子。经基因组PCR验证,黑曲霉营养缺陷型菌株可稳定遗传。利用该转化系统可成功实现增强型绿色荧光蛋白在黑曲霉中的表达。通过结合增强型绿色荧光蛋白和流式细胞仪建立了黑曲霉转化子的高通量筛选模型。 展开更多

关键词 黑曲霉 CRISPR/Cas9 基因敲除 尿嘧啶营养缺陷型 增强型绿色荧光蛋白(egfp)

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抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26～28kDa单链抗体与EGFP的融合表达及靶向性研究 被引量：3

11

作者 何卓 汪世平 +6 位作者 周帅锋 秦永华 高冬梅 汪希雅 李林 余路新 徐绍锐 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期704-707,共4页

目的体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26-28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位，探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值。方法扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因．克隆至PET32a／SIEA26～28kDa-scFv质粒，构建PET... 目的体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26-28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位，探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值。方法扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因．克隆至PET32a／SIEA26～28kDa-scFv质粒，构建PET32a／EGFP-scFv质粒。转化至感受态E．coli BL21（DE3）中。并诱导表达单链抗体融合蛋白。分析单链抗体融合蛋白与SIEA26～28kDa的结合特异性。单链抗体融合蛋白与日本血吸虫成虫、虫卵切片孵育，荧光显微镜下观测GFP信号。确定特异性单链抗体的靶向性。结果重组质粒PET32a／EGFP-scFv构建成功．Trx-EGFP-scFv融合蛋白高效表达．与SIEA26-28kDa特异性结合。GFP信号主要集中在未成熟卵卵胚．雌虫卵巢、卵黄腺及与生殖系统邻近的肠腔组织。结论SIEA26-28kDa单链抗体与血吸虫未成熟卵胚胎及雌虫生殖系统具有较强的靶向性，具有潜在抗卵胚发育、抗雌虫生殖作用，为SIEA26-28kDa单链抗体在抗日本血吸虫病疫苗免疫靶向方面的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 日本血吸虫 未成熟卵可溶性抗原(SIEA) 单链抗体(scFv) 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 靶向性

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重组宁乡猪生长激素真核表达质粒(pCI-GH-EGFP)的构建及其在Vero细胞中的表达 被引量：2

12

作者 王文策 翟双双 +4 位作者 耿梅梅 褚武英 魏永伟 于涟 杨琳 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第7期86-89,277,共5页

为了构建宁乡猪生长激素(GH)真核表达系统,并转染非洲绿猴肾细胞系(Vero)观察其表达情况,试验选用宁乡猪脑垂体组织总RNA反转录获得的c DNA为模板,克隆宁乡猪生长激素(nxGH)基因序列,将其定向插入p CI载体构建重组质粒p CI-GH,并将增强... 为了构建宁乡猪生长激素(GH)真核表达系统,并转染非洲绿猴肾细胞系(Vero)观察其表达情况,试验选用宁乡猪脑垂体组织总RNA反转录获得的c DNA为模板,克隆宁乡猪生长激素(nxGH)基因序列,将其定向插入p CI载体构建重组质粒p CI-GH,并将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因酶切后连入质粒p CI-GH中,构建真核表达载体p CI-GH-EGFP。将该重组质粒在脂质体作用下转染Vero细胞,倒置荧光显微镜下观察到GH-EGFP融合蛋白可稳定表达。结果表明:宁乡猪生长激素基因编码区序列含有1个由651个核苷酸组成的开放阅读框(ORF),编码216个氨基酸残基。 展开更多

关键词 宁乡猪 生长激素(GH)基因 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 克隆 真核表达

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天然型EGFP在无细胞翻译系统中的可溶表达 被引量：1

13

作者 赵琪 黄学文 朱海林 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2007年第3期225-227,231,共4页

目的:构建能在无细胞翻译系统中表达天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的原核表达载体。方法:以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,NcoI和HindⅢ双酶切EGFP基因和pET28a载体。T4 DNA连接酶连接,转化E.coliDH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定。... 目的:构建能在无细胞翻译系统中表达天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的原核表达载体。方法:以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,NcoI和HindⅢ双酶切EGFP基因和pET28a载体。T4 DNA连接酶连接,转化E.coliDH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定。正确重组的载体命名为pET28a-EGFP。在无细胞翻译系统中加入大抽后的pET28a-EGFP模板(0.6 mg/ml),孵育3 h。荧光显微镜观察荧光。Western blot鉴定EGFP。结果:测序证实重组EGFP基因序列与基因库中的序列完全一致,荧光显微镜下观察到无细胞翻译系统中强烈荧光,Western blot证实分子量约为27 kD的EGFP高效表达。结论:成功构建了能在无细胞翻译系统中高效表达可溶性天然型EGFP的pET28a-EGFP载体,为进一步建立荧光强度标准物奠定了基础。 展开更多

关键词 增强绿色荧光蛋白(egfp) 重组载体 无细胞翻译系统 原核表达

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Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中启动子P_(aziU1)的克隆及表达 被引量：1

14

作者 周俊 何璟 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期26-31,共6页

为鉴定和分析aziU1基因的启动子PaziU1,将该基因上游183bp的DNA片段和组成型强启动子PermE*(作为阳性对照)分别克隆到启动子探针载体pIJ8660中,以增强型的绿色荧光蛋白基因(egfp)作为报告基因,通过检测菌丝体中绿色荧光的强弱,对PaziU1... 为鉴定和分析aziU1基因的启动子PaziU1,将该基因上游183bp的DNA片段和组成型强启动子PermE*(作为阳性对照)分别克隆到启动子探针载体pIJ8660中,以增强型的绿色荧光蛋白基因(egfp)作为报告基因,通过检测菌丝体中绿色荧光的强弱,对PaziU1的启动子活性进行了定性和定量分析。PaziU1在3种不同的链霉菌Streptomyces sahachiroi、Streptomyces lividans ZX1和Streptomyces albus中均表现出启动子活性。PaziU1的启动子活性在初始培养的36h略低于PermE*,在培养48h后,PaziU1的表达活性高于PermE*。结果表明,Pazi U1与PermE*一样,是一个可以在链霉菌中组成型表达的强启动子。 展开更多

关键词 STREPTOMYCES sahachiroi ATCC 33158 PermE* 启动子探针载体 PaziU1 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 组成型强启动子

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携带EGFP基因的戊型肝炎病毒重组质粒的构建及其感染性的验证 被引量：1

15

作者 李云龙 龙飞燕 +7 位作者 杨臣臣 禹文海 毕艳红 王珏 姜典财 彭福春 井申荣 黄芬 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期529-537,共9页

为了构建携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组质粒,转染人肺癌细胞A549细胞验证其感染性,PCR法分两段扩增HEV全基因组序列和EGFP基因序列,将EGFP报告基因... 为了构建携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组质粒,转染人肺癌细胞A549细胞验证其感染性,PCR法分两段扩增HEV全基因组序列和EGFP基因序列,将EGFP报告基因插入到HEV ORF2基因下游,并克隆到体外转录表达载体pGEM-7Zf(+)上。然后利用脂质体转染法将重组质粒转入A549细胞,24h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达;转染72h后,利用免疫荧光法检测HEV ORF2蛋白的表达。转染7d后将发生病变的A549细胞收集作为接种物,接种A549细胞验证携带EGFP的HEV-EGFP重组病毒的感染性。结果显示经酶切和测序鉴定携带EGFP的HEV重组表达质粒pGEM-HEV-EGFP构建成功;EGFP基因与HEV在A549细胞中可融合表达;携带EGFP的HEV重组表达质粒转染A549细胞7d后出现病变,并且连续传代3代仍具有感染性。本研究成功构建了携带EGFP的HEV全基因组重组质粒pGEM-HEV-EGFP,并成功感染A549细胞,为进一步研究HEV的复制机制及致病机理奠定基础。 展开更多

关键词 戊型肝炎病毒(HEV) 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 感染性

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SOEing法构建EGFP真核表达载体及其在杜氏盐藻中的表达 被引量：1

16

作者 李杰 闫红霞 +3 位作者 曲东京 刘红涛 鲁照明 薛乐勋 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期546-551,共6页

通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,SOEing)构建含有杜氏盐藻(Dunaliella salina)硝酸盐还原酶(NR)基因5′-上游序列(Pnr)and 3′-端序列(Tnr)的EGFP真核表达载体,并将其转化杜氏盐藻。利用改进的SOEing法,... 通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,SOEing)构建含有杜氏盐藻(Dunaliella salina)硝酸盐还原酶(NR)基因5′-上游序列(Pnr)and 3′-端序列(Tnr)的EGFP真核表达载体,并将其转化杜氏盐藻。利用改进的SOEing法,将杜氏盐藻NR基因Pnr与报告基因EGFP cDNA融合,并与pEGM-7zf克隆载体连接,顺序将盐藻NR基因Tnr序列与融合片段相连,构建含Pnr-EGFP-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NET。电击法转化杜氏盐藻,在盐藻转化株中观察到了EGFP的瞬时表达。此研究为转基因杜氏盐藻研究和成功建立杜氏盐藻生物反应器奠定了实验基础。 展开更多

关键词 杜氏盐藻 重叠区扩增基因拼接法(SOEing) 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 真核表达载体

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两种方法介导外源基因稳定转染大鼠肝癌细胞株的有效性及其对细胞生长影响的比较

17

作者 杨天燕 王劲 +2 位作者 张靖贤 王乃平 韦锦斌 《西部医学》 2010年第10期1785-1789,共5页

目的探讨磷酸钙共沉淀法与阳离子脂质体试剂形成复合物法两种基因转染方法构建大鼠肝癌细胞克隆株的有效性及对生长影响的比较。方法将携带增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1分别用脂质体形成复合物法、磷酸钙共沉淀法导入大鼠... 目的探讨磷酸钙共沉淀法与阳离子脂质体试剂形成复合物法两种基因转染方法构建大鼠肝癌细胞克隆株的有效性及对生长影响的比较。方法将携带增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1分别用脂质体形成复合物法、磷酸钙共沉淀法导入大鼠肝癌CBRH-7919细胞,G418筛选基因稳定转染阳性单细胞克隆株。RT-PCR法检测EGFP基因在细胞中的表达。结果两种方法转染CBRH-7919细胞24h后,倒置相差荧光显微镜下观察均见绿色荧光。G418加压筛选14d后均形成阳性克隆,倒置相差荧光显微镜下可见绿色荧光,脂质体法的细胞克隆荧光强度强于磷酸钙。阳性克隆株经RT-PCR法检测,750bp于450bp处均有特异性条带。结论两种细胞转染方法均可使增强型绿色荧光蛋白基因稳定转染CBRH-7919,为今后探讨外源目的基因对靶细胞生长特性的影响奠定前期实验基础。 展开更多

关键词 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 真核表达载体 基因转染 稳定转染 肝癌细胞

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EGFP基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

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作者 郑立恒 魏会平 +4 位作者 许松梅 何波 杨明理 王黎明 刘全胜 《河北北方学院学报（医学版）》 2006年第4期17-19,共3页

目的:探讨外源性EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞(m esenchymal stem cells,MSCs)的可行性。方法:用增强型荧光绿色蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报告基因,以脂质体法转染骨髓间充质干细胞,观察转染结果、表... 目的:探讨外源性EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞(m esenchymal stem cells,MSCs)的可行性。方法:用增强型荧光绿色蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报告基因,以脂质体法转染骨髓间充质干细胞,观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响。结果:经荧光显微镜下观察证实:成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染。结论:兔骨髓间充质干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养;骨髓间充质干细胞可直接作为基因靶细胞,建立稳定表达EGFP的骨髓间充质干细胞系具有可行性,为进一步做标记的MSCs细胞的移植研究奠定基础。 展开更多

关键词 增强型绿色荧光蛋白(egfp) 转染 骨髓间充质干细胞(MSCs)

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稳定表达未折叠蛋白反应荧光报告基因的SH-SY5Y细胞系建立

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作者 孙建强 朱伟 +8 位作者 陈昱 姜树原 刘晓蕾 谢雅彬 谢伟 巴德仁贵 邵国 贾小娥 马宁 《中国老年学杂志》 CAS 北大核心 2023年第23期5757-5763,共7页

目的通过稳定表达70 kD热休克蛋白(HSP)4重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的SH-SY5Y细胞系,直观实时反映细胞内未折叠蛋白反应(UPR)的变化。方法以SH-SY5Y细胞的cDNA为模板,克隆HSPA4,并连接EGFP。将HSPA4-EGFP连接入慢病毒载... 目的通过稳定表达70 kD热休克蛋白(HSP)4重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的SH-SY5Y细胞系,直观实时反映细胞内未折叠蛋白反应(UPR)的变化。方法以SH-SY5Y细胞的cDNA为模板,克隆HSPA4,并连接EGFP。将HSPA4-EGFP连接入慢病毒载体中,慢病毒转染SH-SY5Y细胞。使用3μg/ml嘌呤霉素处理细胞1个月,筛选得到HSPA4-EGFP稳转系。通过实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)、Western印迹、共聚焦显微镜检测等方法,证实HSPA4-EGFP稳转系能有效且实时反映UPR的变化。结果扩增到HSPA4-EGFP,并成功构建HSPA4-EGFP稳定表达的UPR报告系统。QPCR检测表明,构建的报告系统可以指示UPR。在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内绿色EGFP的点状分布,其能够反映UPR错误折叠蛋白的多少及分布,分别加入UPR激活剂、抑制剂后,细胞内绿色EGFP的点状分布明显增多和减少,差异有统计学意义(P<0.05)。Western印迹检测到细胞中HSPA4-EGFP融合蛋白表达条带。结论成功构建HSPA4-EGFP稳转系,能够直观实时反映UPR变化,为深入研究UPR及其相关疾病(包括老年性疾病)提供工具。 展开更多

关键词 未折叠蛋白反应(UPR) 70 kD热休克蛋白4重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(egfp) SH-SY5Y细胞

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反转录病毒载体介导的EGFP基因在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中的表达 被引量：1

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作者 王婧 李昌 +6 位作者 李林溪 胡博 丛艳昭 任大勇 王卓越 杜寿文 金宁一 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第3期40-42,共3页

为了构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的反转录病毒载体,并观察EGFP基因在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中的表达情况。试验将增强型绿色免疫荧光基因片段定向插入反转录病毒载体pFB-neo,获得重组反转录病毒质粒pFB-NE,利用三质粒... 为了构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的反转录病毒载体,并观察EGFP基因在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中的表达情况。试验将增强型绿色免疫荧光基因片段定向插入反转录病毒载体pFB-neo,获得重组反转录病毒质粒pFB-NE,利用三质粒共转染系统,将含有目的基因的重组反转录病毒质粒pFB-NE以及含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK-293细胞,用产生的重组反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,并在荧光显微镜下观察EGFP基因的表达。结果表明:重组反转录病毒载体pFB-NE构建正确,重组病毒包装成功,EGFP基因在细胞中能够稳定表达。 展开更多

关键词 反转录病毒载体 增强型绿色荧光蛋白(egfp) SP2/0小鼠骨髓瘤细胞

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