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敲低维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)抑制全反式维甲酸诱导的NB4急性早幼粒白血病细胞的分化 被引量：1
1
作者 陈磊 苏卫东 +1 位作者 邱丽君 庞华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期756-760,共5页
目的探讨慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)敲低NB4急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)对全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化的影响及其机制。方法将含有人RIG-Ⅰ基因shRNA序列(RIG-Ⅰ-shRNA)及含绿色荧光蛋白(GFP)基... 目的探讨慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)敲低NB4急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)对全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化的影响及其机制。方法将含有人RIG-Ⅰ基因shRNA序列(RIG-Ⅰ-shRNA)及含绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒感染NB4细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)及Western blot法分别检测ATRA诱导前后NB4细胞RIG-Ⅰ mRNA和蛋白水平;流式细胞术观察慢病毒感染效率和RIG-Ⅰ-shRNA对ATRA诱导NB4细胞分化的影响;Western blot法检测敲低RIG-Ⅰ水平后,ATRA处理对蛋白激酶B308位苏氨酸(AKT-Thr308)磷酸化的调控效应。结果含RIG-Ⅰ-shRNA序列的慢病毒可成功感染NB4细胞,下调ATRA诱导的RIG-Ⅰ水平;敲低RIG-Ⅰ后,明显抑制ATRA诱导NB4细胞分化,同时上调AKT-Thr308磷酸化水平。结论敲低NB4细胞RIG-Ⅰ蛋白可上调AKT-Thr308磷酸化水平抑制ATRA诱导的急性早幼粒白血病细胞分化。 展开更多
关键词 维甲酸诱导基因ⅰ(rig-ⅰ) 慢病毒 RNA干扰技术(RNAi) 细胞分化 蛋白激酶B(AKT)
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小鼠Rig-Ⅰ蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备
2
作者 陈磊 李成洋 奚绪光 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第8期6-12,共7页
【目的】进一步研究小鼠维甲酸诱导基因Ⅰ(Rig-Ⅰ)蛋白的细胞信号传导、结构与功能。【方法】利用已经构建好的逆转录病毒载体MigRI-Rig-Ⅰ,用PCR方法扩增出小鼠Rig-Ⅰ基因氨基端100 bp长度的片断(Rig-Ⅰ-N),将此片段定向克隆到原核表... 【目的】进一步研究小鼠维甲酸诱导基因Ⅰ(Rig-Ⅰ)蛋白的细胞信号传导、结构与功能。【方法】利用已经构建好的逆转录病毒载体MigRI-Rig-Ⅰ,用PCR方法扩增出小鼠Rig-Ⅰ基因氨基端100 bp长度的片断(Rig-Ⅰ-N),将此片段定向克隆到原核表达载体pGEX-4T2中,构建pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N,再将Rig-Ⅰ基因剩余部分克隆到已构建有Rig-Ⅰ-N部分片段的pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N中,构建融合表达载体pGEX-4T2-Rig-Ⅰ,将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,对表达产物GST-Rig-Ⅰ融合蛋白进行纯化,制备抗体,并对抗体效价进行ELISA检测及抗体特异性的Western blot分析。【结果】重组蛋白GST-Rig-Ⅰ能在大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白GST-Rig-Ⅰ纯化和洗脱后分子质量为130 ku,纯度>90%,制备的抗体效价达到1∶625 000,并且能够识别在原核表达系统以及真核细胞内表达的小鼠Rig-Ⅰ蛋白。【结论】建立的表达系统能够表达重组蛋白GST-Rig-Ⅰ,制备的抗体具有良好的免疫特异性。 展开更多
关键词 小鼠 维甲酸诱导基因ⅰ(rig-ⅰ) 原核表达 抗体制备
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应用CRISPR-Cas9技术构建RIG-Ⅰ基因敲除的HEK293细胞系 被引量：1
3
作者 陈姿亦 吴怡蓉 +1 位作者 张雨婷 高有领 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期4254-4265,共12页
为了揭示维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid inducible-geneⅠ,RIG-Ⅰ)基因敲除对Ⅰ型干扰素信号通路中关键因子的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了RIG-Ⅰ基因敲除的HEK293细胞。首先设计了3条针对靶标基因的单向导RNA(single guide ... 为了揭示维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid inducible-geneⅠ,RIG-Ⅰ)基因敲除对Ⅰ型干扰素信号通路中关键因子的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了RIG-Ⅰ基因敲除的HEK293细胞。首先设计了3条针对靶标基因的单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并构建了pX459重组载体。重组载体转染HEK293细胞后,通过嘌呤霉素筛选细胞株,再以聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosinic acid-polycytidylicacid,poly I:C)为病毒模拟物转染细胞,通过基因测序、荧光定量PCR、免疫印迹和免疫荧光的方法检测RIG-Ⅰ基因的敲除情况,同时对Ⅰ型干扰素信号通路中的黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated protein 5,MDA5)、干扰素β1(interferonβ1,IFNβ1)和核转录因子kappa B p65[nuclear transcription factor kappa B p65,NF-κb(p65)]等关键因子以及细胞活力进行分析。结果表明,本研究成功构建了2株稳定敲除RIG-Ⅰ基因的HEK293细胞株(S1和S3),RIG-Ⅰ在S1和S3中的基因转录水平和蛋白质表达水平均显著低于野生型细胞(P<0.05)。S1和S3细胞株的MDA5和IFNβ1基因转录水平和S3细胞株的NF-κB(p65)蛋白质水平显著低于野生细胞株(P<0.05);细胞免疫荧光分析结果表明,poly I:C转染细胞后,与野生型相比,S1细胞株核外存在较多的NF-κB(p65)蛋白。此外,polyI:C转染细胞48h后,显著降低了野生型和S1细胞株的活力(P<0.05),但是不影响S3细胞株的活力。综上所述,本实验通过CRISPR/Cas9系统成功构建了2株RIG-Ⅰ基因敲除的HEK293细胞,为进一步研究I型干扰素信号通路的机制提供了稳定的细胞模型。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 维甲酸诱导基因ⅰ(rig-I) 基因敲除 HEK293细胞 干扰素
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RIG-I介导的TLR非依赖性模式识别
4
作者 叶慧燕 熊思东 《生命的化学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期302-304,共3页
天然免疫在机体抗病毒感染的过程中发挥重要作用。近年来,识别和感受病原体的一系列模式识别受体受到广泛关注,TLR(Toll-like receptor)便是这一领域中的热点,随着研究的深入,一类TLR非依赖性模式识别受体,逐渐活跃在天然免疫识别的舞台... 天然免疫在机体抗病毒感染的过程中发挥重要作用。近年来,识别和感受病原体的一系列模式识别受体受到广泛关注,TLR(Toll-like receptor)便是这一领域中的热点,随着研究的深入,一类TLR非依赖性模式识别受体,逐渐活跃在天然免疫识别的舞台,这其中,解旋酶(helicase)家族中的重要成员——维甲酸诱导基因I(retinoic acid-inducedgeneI,RIG-I),主要识别并直接结合到某些5'端磷酸化RNA病毒,通过蛋白质-蛋白质接触方式,与其受体MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)也称作VISA(virus induced signaling adaptor)、IPS-1(IFN-promoter stimulating factor)或Cardif结合,活化TBK1和IKKe,激活转录因子NF-kB、IRF-3,引起I型干扰素分泌上调,发挥抗病毒效应。RIG-I途径除了在天然免疫中发挥抗病毒作用以外,也是一些病毒逃逸机体免疫的靶点,如HCV、HAV、GB病毒等。 展开更多
关键词 维甲酸诱导基因(rig-ⅰ) ⅰ型干扰素 抗病毒免疫
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