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RANTES-K慢病毒载体的构建及其慢病毒的产生和鉴定 被引量:2
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作者 孙利 张颖 +6 位作者 黄长形 张久聪 连建奇 张野 魏欣 孙永涛 白雪帆 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第3期247-250,共4页
目的:构建含CC细胞内趋化因子(CC-intrakine,RANTES-K)基因的慢病毒载体,为研究I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的基因治疗奠定基础.方法:应用PCR技术,扩增目的基因片段RANTES-K,纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6/V5-D-TOPO(载体,构建慢... 目的:构建含CC细胞内趋化因子(CC-intrakine,RANTES-K)基因的慢病毒载体,为研究I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的基因治疗奠定基础.方法:应用PCR技术,扩增目的基因片段RANTES-K,纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6/V5-D-TOPO(载体,构建慢病毒载体pLenti6/V5-R-K,并在293FT细胞中建立慢病毒株,最后转染HeLa细胞观察RANTES蛋白的表达.结果:成功构建了慢病毒载体pLenti6/V5-R-K,并证实RANTES蛋白可在人宫颈癌HeLa细胞系内表达.结论:慢病毒载体可介导CC-intrakine(RANTES-K)基因高效稳定转染HeLa细胞,可用于抗HIV-1感染的基因治疗. 展开更多
关键词 HIV-1 趋化因子受体 细胞趋化因子 慢病毒载体 基因治疗
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趋化因子融合蛋白SDF-KDEL慢病毒载体pLenti6/V5-S-K的构建和表达 被引量:1
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作者 孙利 曲晓莉 +11 位作者 张久聪 张颖 黄长形 连建奇 魏欣 姜泓 张野 庄严 翟嵩 孙永涛 聂青和 白雪帆 《中国感染控制杂志》 CAS 2008年第6期367-371,共5页
目的构建含趋化因子融合蛋白SDF-KDEL的慢病毒载体pLenti6/V5-S-K,为研究I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的基因治疗奠定基础。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段SDF-KDEL,纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6/V5-D-TOPO(载体... 目的构建含趋化因子融合蛋白SDF-KDEL的慢病毒载体pLenti6/V5-S-K,为研究I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的基因治疗奠定基础。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段SDF-KDEL,纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6/V5-D-TOPO(载体,构建慢病毒载体pLenti6/V5-S-K,并在293FT细胞中建立慢病毒株,最后转染人宫颈癌HeLa细胞观察SDF-1蛋白的表达。结果成功构建了慢病毒载体pLenti6/V5-S-K,并证实SDF-1蛋白可在HeLa细胞系内表达。结论慢病毒载体可介导CXC-细胞内趋化因子(CXC-in-trakine,SDF-K)基因高效、稳定转染HeLa细胞,可用于抗HIV-1感染的基因治疗。 展开更多
关键词 人免疫缺陷病毒 Ⅰ型 趋化因子受体 细胞趋化因子 慢病毒载体 基因治疗 SDF-KDEL pLenti6/V5-S-K
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一种对趋化因子受体4具有表型剔除效应的重组腺毒表达载体的构建及其体外检测
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作者 陈宏远 芮雯 《中国医药指南》 2009年第16期50-53,共4页
目的构建含有人趋化因子突变体SDF-1α/54及内质网定位肽段KDEL基因细胞内趋化因子突变体的重组腺病毒表达载体,并在体外探讨对CXCR4的作用。方法以质粒pcDNA3.1/SDF-1为模板,通过PCR扩增获得SDF-1α/54/KDEL基因全长序列。PCR产物回收... 目的构建含有人趋化因子突变体SDF-1α/54及内质网定位肽段KDEL基因细胞内趋化因子突变体的重组腺病毒表达载体,并在体外探讨对CXCR4的作用。方法以质粒pcDNA3.1/SDF-1为模板,通过PCR扩增获得SDF-1α/54/KDEL基因全长序列。PCR产物回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL。通过酶切、PCR及插入片段测序鉴定,将正确重组体pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL转化E.coliBJ5183并进行细菌内同源重组,然后筛选阳性克隆,提取质粒,将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体Lipofectamine2000介导转染293细胞。制备AdSDF-1α/54/KDEL病毒上清并测定其滴度,将病毒上清转染293细胞,应用RT-PCR分析SDF-1α/54/KDEL的表达。重组病毒感染MCF-7后,MTT法检测其细胞毒性;流式细胞仪检测重组腺病毒对肿瘤细胞表面CXCR4表达的影响。结果通过细菌内同源重组法构建了含SDF-1α/54/KDEL目的基因的重组腺病毒载体AdSDF-1α/54/KDEL,RT-PCR鉴定表明经重组腺病毒转染的293细胞可有效转录SDF-1α/54/KDEL,证实其在293细胞中高效表达并产生6×109PFU/mL的重组腺病毒;AdSDF-1α/54/KDEL处理的乳腺癌细胞,MOI在200以内无细胞毒性对细胞生长生长无影响,但能显著降低肿瘤细胞表面CXCR4的表达量。结论本次构建的细胞内趋化因子突变体重组腺毒表达载体AdSDF-1α/54/KDEL的构建成功,并具有对乳腺癌细胞系MCF-7具有表型剔除作用。 展开更多
关键词 细胞趋化因子 趋化因子受体4 基质细胞衍生因子1 腺病毒
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淋巴细胞HIV-1辅受体表型剔除阻断病毒感染的研究
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作者 张颖 白雪帆 +4 位作者 李靖 张岩 王九平 孙永涛 黄长形 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期72-75,共4页
目的 观察HIV 1辅受体CCR5和CXCR4表型剔除对HIV 1DP1株感染的阻断作用。方法 用含有pLNCX R K S K的重组逆转录病毒液感染原代人PBLs(外周血淋巴细胞 ) ,抗体 免疫磁珠法分离筛选转化成功PBLs,流式细胞仪检测筛选效率 ;HIV 1DP1株... 目的 观察HIV 1辅受体CCR5和CXCR4表型剔除对HIV 1DP1株感染的阻断作用。方法 用含有pLNCX R K S K的重组逆转录病毒液感染原代人PBLs(外周血淋巴细胞 ) ,抗体 免疫磁珠法分离筛选转化成功PBLs,流式细胞仪检测筛选效率 ;HIV 1DP1株攻击转化PBLs ,进行合胞体形成和p2 4抗原分泌检测。结果 抗 NGFR 免疫磁珠法获得了转化成功的PBLs ,流式细胞仪检测发现pLNCX R K S K转染组 77.4%的PBLsNGFR(神经生长因子受体 )标记物为阳性 ;HIV 1DP1株攻击后 ,未转染组和pLNCX转染组可以见到明显的合胞体形成 ,而在pLNCX R K S K转化PBLs没有见到合胞体形成 ;pLNCX R K S K转染组在感染后第 4、7和 10天皆可发现显著的p2 4抗原分泌抑制 ,抑制率分别为 15%、43 %、19%。结论 细胞内趋化因子通过与CCR5和CXCR4细胞内结合 ,使HIV 1两类主要辅受体难以在PBLs表面表达 ,从而可以达到阻断HIV 展开更多
关键词 淋巴细胞 HIV-1 辅受体 病毒感染 细胞趋化因子 流式细胞
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