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小麦叶片蛋白质组的2D-LC分离及Nano LC-MS/MS分析 被引量：9
1
作者 刘静 潘映红 +3 位作者 徐琴 罗继 徐世昌 赵奎军 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期772-780,共9页
【目的】二维液相色谱(2D-LC)与双向电泳(2-DE)技术具有互补性,本文旨在探讨利用2D-LC和纳升级液相色谱串联质谱(Nano LC-MS/MS)技术分离鉴定小麦叶片蛋白质组的新方法。【方法】小麦叶片蛋白经提取、脱盐后,进行第一维阴离子交换分离;... 【目的】二维液相色谱(2D-LC)与双向电泳(2-DE)技术具有互补性,本文旨在探讨利用2D-LC和纳升级液相色谱串联质谱(Nano LC-MS/MS)技术分离鉴定小麦叶片蛋白质组的新方法。【方法】小麦叶片蛋白经提取、脱盐后,进行第一维阴离子交换分离;收集洗脱组分进行SDS-PAGE分析,并对非高丰度蛋白组分进行第二维反相液相色谱分离;随机选择含较低吸收峰的部分组分经胰蛋白酶水解后进行Nano LC-MS/MS分析;将串联质谱数据通过MASCOT搜索NCBInr和EST数据库,并对二级质谱获得的蛋白序列进行MSBLAST分析。【结果】经第一维阴离子交换色谱分离,收集得到15个组分,其中第15组分包含小麦叶片丰度最高的蛋白——1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO);其余14个组分经反相液相色谱分离,共收集1551个组分,获得1867个色谱峰;随机对其中6个含较低吸收峰的收集组分酶解和Nano LC-MS/MS检测,9种蛋白得到鉴定。【结论】结果初步表明,利用2D-LC和Nano LC-MS/MS技术可有效地分离和鉴定小麦叶片蛋白质组,为更深入全面地研究小麦叶片蛋白质组奠定基础。 展开更多
关键词 蛋白质组学 小麦叶片 二维液相色谱 纳升级液相色谱串联质谱
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亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱法鉴定水稻蛋白质 被引量：5
2
作者 高欢欢 马有宁 +5 位作者 林晓燕 柴爽爽 秦美玲 张涵彤 何巧 陈铭学 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2018年第5期650-657,共8页
建立了亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱分析水稻叶片蛋白质组学的方法。利用标准肽段系统分析了液相色谱流动相酸碱度对二维亲水作用-反相色谱系统正交性的影响。结果表明,第一维亲水作用色谱在碱性(pH 9.3)和第二维反相色谱在酸性(p... 建立了亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱分析水稻叶片蛋白质组学的方法。利用标准肽段系统分析了液相色谱流动相酸碱度对二维亲水作用-反相色谱系统正交性的影响。结果表明,第一维亲水作用色谱在碱性(pH 9.3)和第二维反相色谱在酸性(pH 3.3)的条件下,正交性最佳(R^2=0.34113)。在此基础上,结合馏分收集技术进一步评价了本测试系统在水稻叶片蛋白质分析中的正交性。结果表明,在所有馏分收集组分中,鉴定次数小于2次的水稻叶片肽段占总肽段数目的 50%以上,且一维液相色谱馏分收集的肽段在第二维色谱及质谱分离分析中,可以较好地分布在不同时间段的洗脱窗口,表明本研究建立的亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱结合馏分收集技术在复杂水稻叶片蛋白质分离鉴定中可提供良好的的分离正交性。结合水稻蛋白质数据库检索,共鉴定出207345个肽段,归属于2930个蛋白质簇。 展开更多
关键词 亲水作用-反相二维液相色谱 蛋白质 水稻叶片 纳升级液相色谱串联质谱 正交性
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大豆种子蛋白质组样品制备方法研究 被引量：3
3
作者 林杨杰 赵明 +1 位作者 杨生超 潘映红 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期810-817,共8页
以中黄13大豆成熟种子为材料,采用苯酚甲醇醋酸铵法、三氯乙酸丙酮法和尿素硫脲法进行了蛋白质初提与复提,并利用纳升级液相色谱串联质谱技术(Nano LC-MS/MS)分析比较了尿素硫脲法初提和尿素硫脲法初提后苯酚甲醇醋酸铵法复提的样品,以... 以中黄13大豆成熟种子为材料,采用苯酚甲醇醋酸铵法、三氯乙酸丙酮法和尿素硫脲法进行了蛋白质初提与复提,并利用纳升级液相色谱串联质谱技术(Nano LC-MS/MS)分析比较了尿素硫脲法初提和尿素硫脲法初提后苯酚甲醇醋酸铵法复提的样品,以及一维电泳预分离的尿素硫脲法初提样品,旨在构建能有效提高蛋白质提取率和鉴定率的样品制备方法。结果表明:尿素硫脲法初提结合苯酚甲醇醋酸铵法复提的蛋白得率最高,分别达到29.18%与4.08%;尿素硫脲法初提与尿素硫脲法初提后苯酚甲醇醋酸铵法复提样品中共鉴定到2 246个蛋白质组,初提和复提样品之间差异十分明显;每次独立制备的尿素硫脲法初提样品平均可鉴定到1 167个蛋白质组,经一维电泳预分离后平均可鉴定到1 868个蛋白质组。研究表明,采用适当的蛋白质样品制备和预分离方法,能有效提高大豆种子蛋白质的提取率和鉴定率。 展开更多
关键词 大豆种子 蛋白质组学 样品制备 纳升级液相色谱串联质谱
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纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析蜈蚣提取蛋白质 被引量：18
4
作者 陈霞 文红梅 +4 位作者 刘睿 朱栋 李伟 周红光 吴勉华 《分析化学》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2014年第2期239-243,共5页
结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱-串联质谱(nanoRPLC-MS/MS)法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为:上样8μL,经Chrom XP-C18毛细管柱(350μm×0.5 m... 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱-串联质谱(nanoRPLC-MS/MS)法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为:上样8μL,经Chrom XP-C18毛细管柱(350μm×0.5 mm,3μm),2%乙腈(0.1%甲酸)-98%乙腈(0.1%甲酸)梯度洗脱90 min;采用ESI-Q-TOF MS,并在IDA采集模式下分析鉴定蜈蚣提取蛋白质。胶内酶解鉴定到72种蛋白质,直接酶解鉴定到97种蛋白质,二者含26种相同的蛋白质。通过数据库比对,分析了蜈蚣提取蛋白质的生物进程、细胞组分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白质具有结合、酶催化、肌动等功能活性,其中结合活性的蛋白质占的比例较大,且多为能量代谢进程中的相关酶类。 展开更多
关键词 纳升级反相液相色谱-串联质谱 蜈蚣 蛋白质 聚丙烯酰胺凝胶电泳
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应用于原代T细胞酪氨酸磷酸化蛋白质组的高灵敏度分析方法
5
作者 梁富超 柯弥 田瑞军 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期693-701,共9页
酪氨酸磷酸化在T细胞的信号转导过程中发挥着重要的作用,然而其丰度较低,鉴定困难。生物组织样本中分离获得的原代T细胞数量较少,培养和扩增的难度较大,因而常使用永生化细胞系来研究T细胞的酪氨酸磷酸化介导的信号转导过程,这通常会导... 酪氨酸磷酸化在T细胞的信号转导过程中发挥着重要的作用,然而其丰度较低,鉴定困难。生物组织样本中分离获得的原代T细胞数量较少,培养和扩增的难度较大,因而常使用永生化细胞系来研究T细胞的酪氨酸磷酸化介导的信号转导过程,这通常会导致获得与原代T细胞相差较大的结论。因此,本研究发展了一种解析原代T细胞酪氨酸磷酸化修饰信号的高灵敏度的蛋白质组学方法。首先,针对原代T细胞数量有限的问题,本研究优化了一套从小鼠脾脏中分离、活化和扩增T细胞的完整流程,第4天时T细胞数量扩增到7倍以上;其次,针对酪氨酸磷酸化修饰丰度较低、不易被质谱检测的难题,本研究利用SH2超亲体(SH2-superbinder)亲和富集和固定化钛离子亲和色谱(Ti^(4+)-IMAC)技术对抗CD3和抗CD28单克隆抗体共刺激条件下的原代T细胞多肽样品进行了酪氨酸磷酸化多肽富集,并结合纳升液相色谱-串联质谱(nanoLC-MS/MS)进行解析。最终成功从1 mg蛋白质中鉴定到282个酪氨酸磷酸化位点,其中包含T细胞受体膜蛋白CD3胞内区的免疫受体酪氨酸激活序列(ITAM)上的多个酪氨酸磷酸化位点,以及信号转导相关蛋白ZAP70、LAT、VAV1等的重要位点信息。综上,本研究发展了一套深度解析原代T细胞中的酪氨酸磷酸化修饰的高灵敏度蛋白质组学分析流程,有望应用于绘制更接近生理状态下的信号转导网络。 展开更多
关键词 纳升液相色谱-串联质谱 酪氨酸磷酸化 原代T细胞 共刺激 信号转导
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纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析锦灯笼提取物中的蛋白质 被引量：6
6
作者 于海洋 晏嘉泽 +1 位作者 郭明 靳艳 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期362-366,共5页
通过水提、酸沉法得到锦灯笼果实提取物,其中蛋白质含量为188 mg/g(以提取物干重计),共含有18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸占氨基酸总量的31%。基于鸟枪法蛋白质组学的分析方法,用纳升级反相液相色谱-串联质谱(nano-RPLC-MS/MS)系统... 通过水提、酸沉法得到锦灯笼果实提取物,其中蛋白质含量为188 mg/g(以提取物干重计),共含有18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸占氨基酸总量的31%。基于鸟枪法蛋白质组学的分析方法,用纳升级反相液相色谱-串联质谱(nano-RPLC-MS/MS)系统分析锦灯笼果实提取物中蛋白质的酶解产物,结合数据库检索,共鉴定得到60种蛋白质;通过生物信息学分析,得到锦灯笼提取物中的蛋白质具有催化活性、抗氧化活性、酶调节活性、养分贮液囊活性、运输活性、结合活性六大生物活性,其中鉴定到与抗氧化相关的蛋白质有3种,为锦灯笼中蛋白质的功能性质的进一步研究奠定了基础。 展开更多
关键词 纳升级反相液相色谱-串联质谱 蛋白质 锦灯笼
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超滤法结合纳升液相色谱-串联质谱技术分析漏出性胸腔积液中多肽组分 被引量：4
7
作者 陈世范 杨静波 +5 位作者 张敏 李晓鸥 刘晓峰 郭宏华 何成彦 高洪文 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2017年第2期224-230,共7页
漏出性胸腔积液中的多肽和蛋白质等生物分子直接或间接地与机体特定的生理、病理状态相关,反映了肺部或者全身其它部位疾病的信息。本研究利用超滤法将漏出性胸腔积液中的多肽组分进行分离,经脱盐富集后,进行纳升液相色谱-串联质谱分析... 漏出性胸腔积液中的多肽和蛋白质等生物分子直接或间接地与机体特定的生理、病理状态相关,反映了肺部或者全身其它部位疾病的信息。本研究利用超滤法将漏出性胸腔积液中的多肽组分进行分离,经脱盐富集后,进行纳升液相色谱-串联质谱分析。结果表明,在漏出性胸腔积液中共鉴定到来源于52种蛋白的314条多肽,超过一半的肽段来源于纤维蛋白原,并且许多肽段具有阶梯序列的特征。此外,在来源于胶原蛋白和纤维蛋白原的多肽中还发现了大量的脯氨酸氧化修饰。基因本体论富集分析显示,漏出性胸腔积液多肽组分所属蛋白均具有胞外分泌的属性。本研究给出了漏出性胸腔积液中多肽组的序列、等电点、分子量、翻译后修饰等理化参数的分布特征,为进一步寻找肺部疾病相关的多肽标志物提供了可借鉴的参考数据和分析方法。 展开更多
关键词 多肽组 超滤 纳升液相色谱-串联质谱 漏出性胸腔积液
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比较纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱用于自顶向下蛋白质组学（英文） 被引量：3
8
作者 Elijah N.MCCOOL 孙良亮 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期878-886,共9页
自顶向下蛋白质组学的一个重要难题是缺乏与质谱可以在线连用并且可以提供高效蛋白质分离的液相分离技术。毛细管区带电泳与纳升反相色谱都可以与质谱在线连用,并且在复杂蛋白质样品分析方面也都有了显著的提升。在这里,我们首次比较了... 自顶向下蛋白质组学的一个重要难题是缺乏与质谱可以在线连用并且可以提供高效蛋白质分离的液相分离技术。毛细管区带电泳与纳升反相色谱都可以与质谱在线连用,并且在复杂蛋白质样品分析方面也都有了显著的提升。在这里,我们首次比较了先进的纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱平台用于自顶向下蛋白质组学分析。相对于纳升反相色谱-质谱而言,毛细管区带电泳-质谱可以将标准蛋白质样品的消耗量降低10倍,而且保持与纳升反相色谱-质谱相当的蛋白质信号强度。有意思的是,与毛细管区带电泳-质谱相比,纳升反相色谱-质谱可以获得更高的蛋白质分子的气相价态。这个现象可能是由于反相流动相中的高浓度乙腈使得蛋白质变性的更加充分。从1微克的大肠杆菌蛋白质样品中,毛细管区带电泳-串联质谱可以鉴定到159个蛋白质和513个蛋白质变体,而纳升反相色谱-串联质谱仅鉴定到105个蛋白质和277个蛋白质变体。当将大肠杆菌蛋白质的上样量提高到8微克时,纳升反相色谱-串联质谱可以鉴定到245个蛋白质和1004个蛋白质变体。由于纳升反相色谱-串联质谱具有比毛细管区带电泳-串联质谱更高的上样量与更宽的分离窗口,当蛋白质样品量不受限制时,纳升反相色谱-串联质谱具有明显的优势。但是,在痕量样品分析方面,毛细管区带电泳-串联质谱具有更大的潜力。 展开更多
关键词 自顶向下蛋白质组学 毛细管区带电泳-串联质谱 纳升反相色谱-串联质谱 大肠杆菌 高灵敏度
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纳升级反相液相色谱串联质谱法分析海马蛋白质组 被引量：2
9
作者 张冬梅 马慧萍 贾正平 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期118-123,共6页
目的:为了全面了解海龙的蛋白质成分,对其蛋白表达谱进行蛋白质组学分析。方法:应用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取海马药材的蛋白质,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析,将聚丙烯酰胺凝胶电泳条带切下进行胶内酶解处理后,应用纳升级反相液相色谱... 目的:为了全面了解海龙的蛋白质成分,对其蛋白表达谱进行蛋白质组学分析。方法:应用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取海马药材的蛋白质,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析,将聚丙烯酰胺凝胶电泳条带切下进行胶内酶解处理后,应用纳升级反相液相色谱串联质谱(nano RPLC-MS/MS)法系统分析海马提取蛋白质胶内酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。结果:共鉴定到海马蛋白192种,等电点范围为4.06~12.18,相对分子质量范围为3.06×10~3~3.52×10~6,多肽10 680个;通过生物信息学方法分析了海马提取蛋白质的分子功能。得到海马提取物中的蛋白质具有结合、酶催化、肌动、ATP酶等功能活性,其中结合活性的蛋白质占的比例较大。结论:本研究建立了海马的蛋白质表达谱,可为海马药材中蛋白质的深入研究奠定基础,对海马药材有效成分的分析和海马药材鉴别具有重要意义。 展开更多
关键词 海马 蛋白表达谱 蛋白质组 生物信息学 三氯乙酸/丙酮沉淀法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 纳升级反相液相色谱串联质谱
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反相高效液相色谱双梯度洗脱分离肽混合物及质谱分析 被引量：4
10
作者 马岩 张万军 +5 位作者 卫军营 牛明 林虹君 秦伟捷 张养军 钱小红 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期205-211,共7页
复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提。"鸟枪法"(Shotgun)蛋白质组学研究策略通常采用蛋白酶切、二维液相色谱-串联质谱分析肽段混合物从而鉴定蛋白质,其中高效率地分离肽段混合物是关键步骤之一。... 复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提。"鸟枪法"(Shotgun)蛋白质组学研究策略通常采用蛋白酶切、二维液相色谱-串联质谱分析肽段混合物从而鉴定蛋白质,其中高效率地分离肽段混合物是关键步骤之一。本文通过pH梯度结合有机溶剂梯度的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行一维液相色谱分离,按等时间间隔收集馏分并将一个梯度的前段的一个馏分与后段一个馏分混合,然后进行纳升级液相色谱-质谱联用(nanoRPLC-MS/MS)分析。将该方法应用于酵母蛋白质的分离和鉴定,实验结果为:与常规的强阳离子色谱-反相液相色谱-质谱分离鉴定方法相比,采用pH梯度结合有机相梯度的RP-HPLC-RPLC-MS分离鉴定方法多鉴定到567个酵母蛋白质(簇,含有3 035个唯一肽段);其中鉴定到肽段的pI分布范围为3.42～12.01,相对分子质量范围为587.67～3 499.79;蛋白质的pI分布范围为3.82～12.19,相对分子质量范围为3 446.55～432 905。该结果表明这种方法在复杂体系蛋白质组分离鉴定中具有明显的优势,在蛋白质组学研究中有较好的应用前景。 展开更多
关键词 反相高效液相色谱 pH梯度洗脱 有机溶剂梯度洗脱 纳升级反相高效液相色谱-串联质谱 肽混合物 酵母
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