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汉滩病毒G_2重组腺病毒的表达及其基因免疫的研究 被引量：3
1
作者 吴兴安 于澜 +4 位作者 胡刚 张芳琳 白文涛 史梦远 徐志凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期415-417,共3页
目的:在VeroE6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(AdenoG2),并探讨其诱导免疫应答特性。方法:以HTNVAdenoG2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物。以表达产物免疫BALB/c小鼠后,用ELIS... 目的:在VeroE6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(AdenoG2),并探讨其诱导免疫应答特性。方法:以HTNVAdenoG2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物。以表达产物免疫BALB/c小鼠后,用ELISA、微量细胞培养中和试验及淋巴细胞增殖试验检测体液及细胞免疫应答。结果:用HTNVAdenoG2感染VeroE6细胞后,可检测到HTNV糖蛋白G2的表达。用HTNVAdenoG2免疫小鼠后,可诱导产生抗HTNV糖蛋白G2的特异性抗体,抗体效价为1∶40。微量细胞培养中和试验的结果表明,HTNVAdenoG2还可刺激小鼠产生低水平的中和抗体;但淋巴细胞的增殖反应不明显。结论:在VeroE6细胞中成功地表达了HTNV糖蛋白G2。以HTNVAdenoG2免疫小鼠后,主要刺激小鼠产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,而特异性的细胞免疫应答不明显。本研究结果为HTNV基因工程疫苗的研制提供了实验依据。 展开更多
关键词 汉滩病毒 糖蛋白g2 重组腺病毒 免疫
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汉滩病毒糖蛋白G2酵母双杂交诱饵载体的构建及初步鉴定 被引量：2
2
作者 白文涛 张芳琳 +5 位作者 吴兴安 胡刚 于澜 史梦远 王海涛 徐志凯 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第2期105-107,共3页
目的利用Ras募集系统(RRS),构建并鉴定含汉滩病毒囊膜糖蛋白G2的诱饵载体。方法将汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2基因与Ras基因连接,构建嵌合基因Ras-G2及Ras-G2’(G2’无前导肽序列)。将两个嵌合基因分别克隆入酵母表达载体pMet25,并转... 目的利用Ras募集系统(RRS),构建并鉴定含汉滩病毒囊膜糖蛋白G2的诱饵载体。方法将汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2基因与Ras基因连接,构建嵌合基因Ras-G2及Ras-G2’(G2’无前导肽序列)。将两个嵌合基因分别克隆入酵母表达载体pMet25,并转化至酵母温度敏感株cdc25-2,检测其对RRS系统的激活作用。结果限制性内切酶酶切鉴定表明,Met-G2和Met-G2’载体构建正确。激活试验结果为阴性。结论Met-G2和Met-G2’载体可用于从cDNA文库中筛选汉滩病毒受体。 展开更多
关键词 汉滩病毒 糖蛋白g2 酵母双杂交 Ras募集系统(RRS)
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汉滩病毒囊膜糖蛋白G_2基因重组腺病毒的构建与表达 被引量：7
3
作者 吴兴安 张芳琳 +5 位作者 于澜 胡刚 白文涛 史梦远 王海涛 徐志凯 《科学技术与工程》 2004年第5期363-366,370,共5页
获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralD... 获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 。 展开更多
关键词 汉滩病毒 毒囊膜糖蛋白g2 基因重组 腺病毒 基因构建 基因表达 肾综合征出血热
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体外鉴定汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的相互作用 被引量：1
4
作者 郭进军 李青岭 +2 位作者 周倩云 曾爱忠 黄爱龙 《生物技术通报》 CAS CSCD 2008年第5期136-139,共4页
根据汉坦病毒76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR扩增和基因重组获得G2蛋白膜外区81～140片段的GST融合表达质粒以及β3整合素膜外区23～133片段FLAG融合表达质粒。通过SDS-PAGE检测G... 根据汉坦病毒76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR扩增和基因重组获得G2蛋白膜外区81～140片段的GST融合表达质粒以及β3整合素膜外区23～133片段FLAG融合表达质粒。通过SDS-PAGE检测G2片段在BL21表达菌中诱导表达及纯化的效果,Western blot检测β3整合素片段在真核细胞中的表达。将在BL21裂解上清中表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81～140)纯化后与经过GST蛋白预处理的含有β3整合素片段的细胞裂解上清进行孵育,同时以未做任何转染的HEK293细胞裂解上清和无关蛋白GST-TLM作为阴性对照,通过GSTPull-down验证G2蛋白与β3整合素之间的相互作用。结果显示在Pull-down所获蛋白复合物中检测到β3整合素27～133位氨基酸片段产物的存在。结果表明G2蛋白与β3整合素之间可能存在有直接的相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒细胞膜受体提供了进一步证据。 展开更多
关键词 汉坦病毒受体 包膜糖蛋白g2 Β3整合素 gST Pull—down
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汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在毕赤酵母GS115中的表达及鉴定 被引量：1
5
作者 李璞媛 白文涛 +6 位作者 张芳琳 吴兴安 胡刚 刘艳丽 王海涛 张伟 徐志凯 《科学技术与工程》 2007年第8期1577-1581,共5页
构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质... 构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA-G2。酶切鉴定挑取的阳性克隆,转化入GS115工程菌,在含100μg/mLZeocin的YPD培养基上筛选。挑选单菌落,PCR鉴定阳性克隆,用0.5%甲醇诱导表达,并利用SDS-PAGE及Western-Blot鉴定表达产物。序列分析表明所获得的基因片段与编码汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2的基因一致;100μg/mLZeocinYPD培养基上筛选出含pPICZαA-G2转化子,PCR鉴定为阳性克隆;SDS-PAGE可见约70kDa处有目的蛋白表达条带,经Western-Blot证实该条带为汉滩病毒囊膜糖蛋白G2。成功地构建了重组酵母表达载体pPICZαA-G2,并在毕赤酵母中初步表达成功,为今后汉坦病毒囊膜糖蛋白G2表达纯化以及基因工程疫苗的制备奠定了一定基础。 展开更多
关键词 汉坦病毒 囊膜糖蛋白g2 毕赤酵母表达系统 蛋白表达
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汉坦病毒包膜糖蛋白G2重组腺病毒的构建及其在Hela细胞中的表达
6
作者 呼延霆 薛小平 +3 位作者 宋凯 汪桦 杨慧 王伟 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1579-1585,共7页
本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGF... 本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒;用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白,间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体;RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录;荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞,可见报告基因eGFP的表达;间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别,表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒,转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白,为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 汉坦病毒 包膜糖蛋白g2 重组腺病毒
原文传递
一个约30kD膜蛋白作为汉坦病毒候选受体的筛选
7
作者 李青岭 冯涛 +1 位作者 郭进军 黄爱龙 《生物技术通报》 CAS CSCD 2008年第4期125-129,共5页
目的:筛选汉坦病毒包膜糖蛋白G2可能的候选受体或受体辅助分子,方法:根据汉坦病毒76～118株M基因序列设计引物,PCR扩增和基因重组获得G2全长及各功能片段的GST融合表达质粒,SDS-PAGE检测它们在BL21菌中诱导表达及纯化的效果。生物素标... 目的:筛选汉坦病毒包膜糖蛋白G2可能的候选受体或受体辅助分子,方法:根据汉坦病毒76～118株M基因序列设计引物,PCR扩增和基因重组获得G2全长及各功能片段的GST融合表达质粒,SDS-PAGE检测它们在BL21菌中诱导表达及纯化的效果。生物素标记汉坦病毒易感细胞Vero E6和非允许细胞CHO的细胞膜蛋白。将在BL21裂解上清中有表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81-140)纯化后与含有生物素标记的Vero E6细胞膜裂解液进行孵育,同时以非允许细胞CHO和无关蛋白GST-TLM做为阴性对照,通过GST Pull-down分离与G2蛋白特异性结合的细胞膜蛋白。结果:一个约30kD的Vero E6细胞膜蛋白与G2N81～140片段之间存在着特异性的相互作用。结论:该30kD蛋白可能是汉坦病毒细胞膜候选受体或受体辅助分子之一,是病毒入侵细胞的一个相关分子。 展开更多
关键词 汉坦病毒受体 包膜糖蛋白g2 gST Pull-down生物素膜标记
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汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的表达及相互作用
8
作者 李青岭 冯涛 +1 位作者 郭进军 黄爱龙 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期531-534,共4页
目的研究汉坦病毒76-118株包膜糖蛋白G2与β3整合素之间的相互作用。方法根据HV76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR和基因重组获得带有EGFP标签的G2和带有FLAG标签的β3整合素膜外区... 目的研究汉坦病毒76-118株包膜糖蛋白G2与β3整合素之间的相互作用。方法根据HV76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR和基因重组获得带有EGFP标签的G2和带有FLAG标签的β3整合素膜外区片段融合表达质粒,并且在HEK293细胞中进行表达。将表达成功的G2与β3整合素片段进行免疫共沉淀,用Western blot检测它们之间的相互作用。结果成功构建了G2和β3整合素膜外区各片段的融合表达质粒。将各表达质粒转染HEK293细胞进行瞬时表达,Western blot结果显示β3整合素膜外区各功能片段在细胞裂解上清中获得大量表达,而G2蛋白膜外区仅有81-140片段在细胞裂解上清中大量表达。将G2 81-140片段与β3整合素膜外区各功能片段进行免疫共沉淀的结果显示,仅G2 81-140片段和β3整合素27-133片段在细胞中以复合物存在,提示两者之间可能有直接的相互作用。结论汉坦病毒76-118株包膜糖蛋白G2 81-140片段与β3整合素27-133片段在细胞中以复合物的形式存在,两者之间存在着相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒受体提供了进一步的证据。 展开更多
关键词 汉坦病毒 包膜糖蛋白g2 Β3整合素 免疫共沉淀
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单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的基因扩增、克隆及其B细胞抗原表位分析 被引量：2
9
作者 王茜 曾抗 +2 位作者 孙乐栋 周再高 刘凤岩 《第四军医大学学报》 北大核心 2006年第13期1217-1219,共3页
目的:克隆单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白G-2(gG-2)全长基因并对糖蛋白G-2进行B细胞抗原表位预测.方法:用PCR法扩增HSV-2的gG-2基因,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α株后测序.利用Lasergene,C lustal X等软件,进行B细胞抗原表位预测... 目的:克隆单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白G-2(gG-2)全长基因并对糖蛋白G-2进行B细胞抗原表位预测.方法:用PCR法扩增HSV-2的gG-2基因,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α株后测序.利用Lasergene,C lustal X等软件,进行B细胞抗原表位预测.结果:完成单纯疱疹病毒2型(HSV-2)gG-2全长基因克隆.通过B细胞抗原表位分析,发现HSV-1的gG-1和HSV-2的gG-2氨基端的同源性很低.gG-2蛋白在“独特区”存在抗原指数非常强的抗原表位.结论:成功构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)gG-2全长基因克隆,为单纯疱疹病毒感染的诊断试剂的研发及抗单纯疱疹病毒疫苗研究寻找更好的靶位点提供研究材料和参考. 展开更多
关键词 单纯疱疹病毒2型 包膜糖蛋白g-2 基因克隆 抗原表住
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单纯疱疹病毒2型gG-2“独特区”基因的原核表达及其血清学诊断价值
10
作者 孙乐栋 曾抗 +2 位作者 王茜 周再高 刘凤岩 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期372-375,共4页
目的在大肠杆菌中表达HSV-2的gG-2"独特区"基因(gG-2T)并对其免疫学特性进行初步研究。方法克隆HSV-2的gG-2T,并在大肠杆菌中表达gG-2T融合蛋白。通过Western blot和间接ELISA鉴定融合蛋白的活性。结果通过原核系统表达的gG-2... 目的在大肠杆菌中表达HSV-2的gG-2"独特区"基因(gG-2T)并对其免疫学特性进行初步研究。方法克隆HSV-2的gG-2T,并在大肠杆菌中表达gG-2T融合蛋白。通过Western blot和间接ELISA鉴定融合蛋白的活性。结果通过原核系统表达的gG-2T融合蛋白可以与GST多克隆抗体结合并在46 ku附近出现特异性结合条带。并且能够与确诊的HSV-2患者血清反应,而不与HSV-1患者血清和正常人血清反应。结论获得了HSV-2 gG-2T融合蛋白,它可以与GST多克隆抗体特异性结合并且可以同HSV-2型患者血清特异性反应;获得的gG-2T蛋白为研究以gG-2蛋白作为靶区域的诊断试剂盒和疫苗研发打下实验基础。 展开更多
关键词 单纯疱疹病毒 糖蛋白g-2 独特区基因 融合蛋白 表达
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