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利用T载体克隆快速构建布鲁氏菌缺失突变株 被引量：15
1
作者 白耀霞 杨毅 +7 位作者 王玉飞 王同坤 于爽 陈燕芬 付思美 黄留玉 田晋红 陈泽良 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期62-67,共6页
目的:建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率。方法:采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将... 目的:建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率。方法:采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将载体转入布鲁氏菌感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得布鲁氏菌的缺失突变株。结果:结合融合PCR和T载体快速克隆,能够在48h之内构建好突变载体,与传统的酶切连接相比,效率高、周期短。结论:基于T载体快速克隆是一种非常高效的构建突变株的方法,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一种新方法。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 T载体 突变株构建
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pUC19K质粒的构建及其在布鲁氏菌突变株构建中的应用 被引量：12
2
作者 乔凤 陈泽良 +4 位作者 王玉飞 赵瑾 杜昕颖 于雅琴 黄留玉 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1-5,共5页
突变株的构建是细菌基因功能研究的前提。构建了一个可用于布鲁氏菌突变株构建的自杀质粒。在pUC19质粒的多克隆位点插入卡那霉素抗性基因,在该基因两侧添加多个酶切位点,构建成为pUC19K。利用该质粒,构建了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因... 突变株的构建是细菌基因功能研究的前提。构建了一个可用于布鲁氏菌突变株构建的自杀质粒。在pUC19质粒的多克隆位点插入卡那霉素抗性基因,在该基因两侧添加多个酶切位点,构建成为pUC19K。利用该质粒,构建了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因的突变株。结果表明,利用该自杀质粒,通过一轮筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株。pUC19K质粒的构建及成功应用,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一个快速有效的手段,也为布鲁氏菌的基因功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 自杀质粒 突变株构建
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以克隆载体为自杀载体快速构建布鲁氏菌的无痕缺失突变株 被引量：11
3
作者 王玉飞 陈泽良 +5 位作者 赵红庆 苑锡铜 黄留玉 张伶 刘京梅 宋宏彬 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期642-645,共4页
构建突变株是病原微生物致病机理研究的重要手段。以往研究中布鲁氏菌的无痕缺失突变株都采用传统的自杀载体来构建,效率低下。首先对布鲁氏菌的电击转化条件进行了优化,然后选择含有反向筛选基因sacB的pEX18Gm质粒作为自杀载体,构建了... 构建突变株是病原微生物致病机理研究的重要手段。以往研究中布鲁氏菌的无痕缺失突变株都采用传统的自杀载体来构建,效率低下。首先对布鲁氏菌的电击转化条件进行了优化,然后选择含有反向筛选基因sacB的pEX18Gm质粒作为自杀载体,构建了缺失Ⅳ型启动子区的布鲁氏菌无痕缺失突变株。这不仅为构建布鲁氏菌的突变株提供了一个快速有效的技术平台,也为深入研究Ⅳ型分泌系统的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 自杀载体 布鲁氏菌 突变株构建
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金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220 Δnuc1的构建 被引量：6
4
作者 唐俊妮 周锐 +2 位作者 史贤明 康名松 陈焕春 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期43-47,共5页
金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一... 金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2Δnuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220Δnuc1。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 nucl nuc2 同源重组 突变株构建
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重金属铜耐受突变株的高效构建方法
5
作者 傅科鹤 范莉莉 +1 位作者 李园园 熊国勇 《江西科学》 2020年第2期179-182,225,共5页
对常规的农杆菌介导转化方法进行了改进,建立了一种高效构建耐受铜突变株的方法。与传统方法相比,该方法能够提高铜耐受菌株80%的筛选效率;同时,抗生素使用量减少80%。共获得15株高耐受铜的突变株,通过继代培养及纯化后,确定其耐受特性... 对常规的农杆菌介导转化方法进行了改进,建立了一种高效构建耐受铜突变株的方法。与传统方法相比,该方法能够提高铜耐受菌株80%的筛选效率;同时,抗生素使用量减少80%。共获得15株高耐受铜的突变株,通过继代培养及纯化后,确定其耐受特性具有遗传稳定性。PCR与Southern blot验证了突变株确实为T-DNA随机插入。结果表明,该方法能够极大提高耐受铜突变株构建效率。 展开更多
关键词 木霉 耐铜 突变株构建
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狂犬病病毒SRV_9突变株的构建与拯救
6
作者 魏玉荣 易忠 +3 位作者 符子华 马素贞 简子健 胡尔玛西 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期345-350,共6页
为构建人工修饰的狂犬病病毒,首先用人细胞色素C基因替换狂犬病病毒SRV9株基因间隔区中的非必需区域Ψ区并缺失基因组全长cDNA的糖蛋白CD编码区,得到突变型SRV9cDNA质粒。然后,该质粒与表达野生型SRV9四种结构蛋白N、P、G和L的质粒共转... 为构建人工修饰的狂犬病病毒,首先用人细胞色素C基因替换狂犬病病毒SRV9株基因间隔区中的非必需区域Ψ区并缺失基因组全长cDNA的糖蛋白CD编码区,得到突变型SRV9cDNA质粒。然后,该质粒与表达野生型SRV9四种结构蛋白N、P、G和L的质粒共转染BHK-21细胞。免疫荧光试验显示转染细胞中有大量特异性荧光,电子显微镜观察可见大量典型的狂犬病病毒粒子。上述结果表明已成功地拯救出了人工修饰的狂犬病病毒。狂犬病病毒SRV9突变株的成功构建与拯救,为新型狂犬病减毒活疫苗的研究提供了重要的实验工具。 展开更多
关键词 狂犬病病毒SRV9 CD编码区 Ψ区 突变株构建 拯救
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采用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌sae基因缺失突变株
7
作者 唐俊妮 康铭松 +2 位作者 周锐 史贤明 陈焕春 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期698-702,共5页
针对金黄色葡萄球菌sae基因前后两段序列设计两对引物,PCR扩增出sae基因上下游同源臂序列,克隆到穿梭载体pBT2中;两段序列之间用来自质粒p646的Em抗性基因片段连接,作为筛选标记,从而构建同源重组穿梭质粒pBT2Δsae;将pBT2Δsae电转化... 针对金黄色葡萄球菌sae基因前后两段序列设计两对引物,PCR扩增出sae基因上下游同源臂序列,克隆到穿梭载体pBT2中;两段序列之间用来自质粒p646的Em抗性基因片段连接,作为筛选标记,从而构建同源重组穿梭质粒pBT2Δsae;将pBT2Δsae电转化到金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,40℃经过七轮培养,进行抗性培养基筛选和PCR验证,以及RT-PCR观察基因表达水平。获得一株金黄色葡萄球菌sae基因缺失突变株RNΔsae,为进一步研究sae基因的调控机制等提供有用的实验材料。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 sae基因 同源重组 突变株构建
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金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220 △nuc1的构建
8
作者 唐俊妮 周锐 +2 位作者 史贤明 康名松 陈焕春 《畜牧市场》 2009年第1期21-24,共4页
金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcalnuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个... 金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcalnuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2△nuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220△nuc1。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌nuc1 nuc2 同源重组突变株构建
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