卡介苗穿梭表达质粒pMS肿瘤坏死因子的构建与鉴定 被引量：4

1

作者 夏术阶 刘海涛 +2 位作者 孙晓文 韩邦旻 张沂南 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期467-468,共2页

目的　构建分泌性表达肿瘤坏死因子(TNF) α的重组卡介苗。方法　分别以卡介苗(BCG)和TNF αcDNA为模板,通过PCR扩增得到117bp的BCG Ag85B信号肽序列和70 2bp的TNF α基因序列。将BCG Ag85B信号肽序列插入大肠杆菌 卡介苗穿梭质粒pMV2 ... 目的　构建分泌性表达肿瘤坏死因子(TNF) α的重组卡介苗。方法　分别以卡介苗(BCG)和TNF αcDNA为模板,通过PCR扩增得到117bp的BCG Ag85B信号肽序列和70 2bp的TNF α基因序列。将BCG Ag85B信号肽序列插入大肠杆菌 卡介苗穿梭质粒pMV2 61,得到重组质粒pMS。再将TNF α基因序列克隆至pMS中,得到重组质粒pMSTNF。结果　质粒pMSTNF用双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因BCG Ag85B和TNF α正确插入载体pMV2 61。结论　重组质粒pMSTNF可望在BCG中分泌性表达细胞因子TNF α,从而协同加强对肿瘤的杀伤作用,该质粒的成功构建为改造卡介苗。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子 PMS 穿梭表达质粒 鉴定 TNF-α 卡介苗(BCG) Ag85B (TNF)-Α 分泌性表达 信号肽序列 PCR扩增 重组质粒 基因序列 重组卡介苗 cDNA 穿梭质粒 大肠杆菌 杀伤作用 细胞因子 肿瘤疫苗 插入 克隆

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eglA p-Her2/neu-IL-12融合基因穿梭载体的构建 被引量：5

2

作者 刘颖 张文卿 +4 位作者 于红 吕锐 张艳丽 徐腾飞 李丹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期370-373,共4页

目的:构建重组厌氧芽胞梭菌saccharobutylicum内源性β-1,4葡聚糖酶启动子(eglA p人)-表皮生长因子受体2胞外区(hHer2/neu ECD人)-白细胞介素12(rhIL-12)融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-h... 目的:构建重组厌氧芽胞梭菌saccharobutylicum内源性β-1,4葡聚糖酶启动子(eglA p人)-表皮生长因子受体2胞外区(hHer2/neu ECD人)-白细胞介素12(rhIL-12)融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,并探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础。方法:以含有全长hHer2/neu序列的真核表达质粒(pcDNA3.1 hHer2/neu)为模板,采用PCR方法,扩增hHer2/neu ECD基因片段;将其插入重组rhIL-12真核表达质粒pcD-NA6 rhIL-12(p1)中的rhIL-12基因上游,获得pcDNA6 hHer2/neu ECD-rhIL-12(p2)真核表达质粒;设计合成eglAp基因中一段55 bp序列作为模板,通过连续PCR的方法,扩增eglAp片段(335 bp),并构建T-eglA p(p3)亚克隆质粒;通过酶切连接的方法,将eglA p片段插入p2质粒中的hHer2/neu ECD基因上游,构建pcDNA6 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12(p4)真核表达质粒;通过in-fusion技术,将融合基因eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12插入pIMP1穿梭表达质粒,构建重组pIMP1eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12(p5)穿梭表达载体,并进行菌液PCR、酶切及测序鉴定。结果:获得的hHer2/neu ECD和eglA p片段及p2、p3、p4重组质粒、p5融合基因重组穿梭表达载体,其PCR产物和酶切片段大小与预期一致,测序结果证实各基因序列与GenBank中mRNA或DNA序列一致。结论:成功地构建了大肠杆菌-厌氧芽胞梭菌融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础。 展开更多

关键词 eglA启动子 人表皮生长因子受体2胞外区 IL-12 穿梭表达质粒

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大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-2100的构建及应用 被引量：2

3

作者 程继忠 郑波 +1 位作者 海涛 皇甫永穆 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期225-229,共5页

利用分子生物学方法，构建了大肠杆菌分枝杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）穿梭表达质粒ｐＢＣＧ２１００，研究了编码日本血吸虫中国大陆株谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓ... 利用分子生物学方法，构建了大肠杆菌分枝杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）穿梭表达质粒ｐＢＣＧ２１００，研究了编码日本血吸虫中国大陆株谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）抗原基因在卡介苗（ＢａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅＧｕｅｒｉｎ，ＢＣＧ）中的表达。以含人结核杆菌热休克蛋白（Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ，ｈｓｐ）７０基因全长序列的质粒ｐＭＴ７０为模板，扩增出ｈｓｐ７０启动子，测序选出无错配的启动子，将其定向克隆入Ｅ．ｃｏｌｉＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ穿梭质粒ｐＢＣＧ２０００中，构建成Ｅ．ｃｏｌｉＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ穿梭表达质粒ｐＢＣＧ２１００。再将编码ＧＳＴ的ｃＤＮＡ按正确的阅读框顺序，克隆到ｐＢＣＧ２１００中ｈｓｐ７０启动子的下游，得到分枝杆菌表达质粒ｐＢＣＧＧＳＴ。将ｐＢＣＧＧＳＴ电转化入ＢＣＧ中，筛选出重组ＢＣＧ疫苗，经热诱导后所表达的重组ＧＳＴ（ｒＧＳＴ）抗原，为可溶性蛋白，经纯化后，在ＳＤＳＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带，其表达量占ＢＣＧ菌体总蛋白的１３％。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ提示ｒＧＳＴ能与? 展开更多

关键词 穿梭表达质粒 GST 基因表达 纯化 卡介苗

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重组耻垢分枝杆菌Msmc^2-CFP10-ESAT6的构建 被引量：3

4

作者 吴雯 张红宇 +3 位作者 黄汉菊 范兴 罗道泉 吴少庭 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2009年第3期187-190,共4页

目的构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法采用基因拼接(Gene SOEing)法体外扩增结核杆菌1hp-ESAT6融合基因,插入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pB-CG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-C... 目的构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法采用基因拼接(Gene SOEing)法体外扩增结核杆菌1hp-ESAT6融合基因,插入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pB-CG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,构建耻垢疫苗株Msmc2155-CFP10-ESAT6,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,Western blot分析其免疫原性。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,并在耻垢分枝杆菌中经热诱导表达出分子质量单位约为22 ku的CFP10-ESAT6蛋白,该蛋白可被结核病患者血清、鼠抗ESAT6血清和鼠抗CFP10血清识别。结论结核分枝杆菌lhp-ESAT6融合基因在耻垢分枝杆菌中成功表达。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 CFP10 ESAT6 穿梭表达质粒 分枝杆菌 耻垢

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猪β_2肾上腺素能受体基因克隆及穿梭表达质粒的构建 被引量：2

5

作者 王健 王静 +3 位作者 王淼 孔祥雅 祝凤彬 邵小雪 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第18期3691-3699,共9页

【目的】利用重组β2肾上腺素能受体(β2AR)检测β2激动剂类药物,是弥补传统免疫学检测方法不足、实现该类违禁物多残留的快速检测手段。获得高纯度、高亲和力的重组受体是该技术的核心和难点。本文克隆猪β2 AR并构建其重组穿梭表达质... 【目的】利用重组β2肾上腺素能受体(β2AR)检测β2激动剂类药物,是弥补传统免疫学检测方法不足、实现该类违禁物多残留的快速检测手段。获得高纯度、高亲和力的重组受体是该技术的核心和难点。本文克隆猪β2 AR并构建其重组穿梭表达质粒,为筛选最适宜的受体表达系统和表达条件提供基础材料。【方法】克隆猪β2AR并进行序列分析,完成重组穿梭表达质粒构建。首先采集新鲜猪肝组织,提取总RNA,根据GenBank已登录的猪β2AR核苷酸序列(AF000134),设计1对引物并进行RT-PCR扩增。扩增产物切胶回收后与pMD-18T载体于4℃、T4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选后提取克隆质粒并对其作PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析。然后对所获得的基因及编码的氨基酸序列进行在线BLAST分析、系统进化树构建和疏水性分析。为了提高受体蛋白的表达量及受体配体间的亲和力,对该克隆基因作N端截短186个核苷酸改造;为使表达蛋白C端携带6×His标签,对克隆基因C端进行去除终止子改造。将改造后的克隆基因分别插入pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体,连接产物转入NovaBlue感受态细胞,经Amp抗性筛选,挑取单菌落提取质粒并进行鉴定。【结果】经分光光度计检测及琼脂糖凝胶电泳分析,所提猪肝细胞总RNA的纯度、浓度及完整性可满足后续试验要求。RT-PCR产物电泳结果显示,在1 200 bp左右出现1条特异性条带,与预期结果一致。克隆质粒pMD-18T-β2AR经鉴定,证实为阳性重组质粒。测序结果显示,所得猪β2AR基因cDNA序列全长1 257 bp,编码418个氨基酸。该序列已提交至GenBank,登录号为KF023571.1。Compute pI/Mw在线软件预测该蛋白分子质量为46.73 kD。与已发表的猪β2AR(AF000134)相比,基因序列一致性为99.68%,4处发生碱基突变,编码的氨基酸序列一致性为99.28%,3处发生突变,且配体与� 展开更多

关键词 猪 Β2肾上腺素能受体 基因克隆 序列分析 穿梭表达质粒

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分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6重组卡介苗构建研究 被引量：1

6

作者 张红宇 李晓恒 +2 位作者 范兴 罗道泉 吴少庭 《中国热带医学》 CAS 2009年第5期787-789,840,共4页

目的构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗。方法采用基因拼接(Gene SOEing)法,体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因,插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,用电穿孔法将pBCG3... 目的构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗。方法采用基因拼接(Gene SOEing)法,体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因,插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,用电穿孔法将pBCG3000-CFP10-ESAT6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,SDS-PAGE电泳观察CFP10-ESAT6融合蛋白的表达,Westernblot鉴定其生物活性。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,经热诱导表达出约22kDa的CFP10-ESAT6蛋白,可分别被鼠抗ESAT6血清、鼠抗CFP10血清识别。结论分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗构建成功。 展开更多

关键词 融合蛋白 CFP10 ESAT6 重组卡介苗 穿梭表达质粒

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结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA、Mpa基因重组穿梭表达质粒的构建及鉴定 被引量：4

7

作者 张玉清 雷英 +9 位作者 吴芳 章乐 吴江东 曹旭东 朱彬 何丽 邬博 李瑞山 王钊 张万江 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2014年第9期769-774,共6页

目的构建结核杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统中Pup、Dop、PafA和Mpa基因的重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,并对其进行鉴定。方法提取结核杆菌国际标准强毒株H37Rv基因组DNA,以此为... 目的构建结核杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统中Pup、Dop、PafA和Mpa基因的重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,并对其进行鉴定。方法提取结核杆菌国际标准强毒株H37Rv基因组DNA,以此为模板PCR扩增Pup、Dop、PafA和Mpa基因编码序列并测序。扩增产物克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361,并转化E.coli DH5α感受态细胞,利用PCR技术、双酶切技术及基因测序技术对构建的重组穿梭表达质粒进行鉴定。结果 PCR扩增的Pup、Dop、PafA和Mpa基因片段分别为213、1 683、1 377、和1 848bp,与预期长度一致;双酶切鉴定Pup、Dop、PafA和Mpa基因均成功插入穿梭表达质粒pMV361,测序显示插入穿梭表达质粒pMV361的Pup、Dop、PafA和Mpa基因序列与GenBank公布的序列一致。结论成功构建了重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,为进一步研究结核分枝杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 泛素样蛋白-蛋白酶体系统 pMV361 重组穿梭表达质粒

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家蚕BmNaPi基因的克隆表达与酵母穿梭表达质粒的构建 被引量：3

8

作者 孔卫青 杨金宏 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第3期51-55,共5页

磷酸盐是蚕必需的无机物,钠离子依赖性的磷酸盐转运蛋白(Na(+)-dependent phosphate cotransporter,Na-Pi)调节磷酸盐在生物体内的代谢和转运。本研究通过生物信息学分析和分子生物学试验获得了家蚕NaPi的同源基因BmNaPi,该基因位于家蚕... 磷酸盐是蚕必需的无机物,钠离子依赖性的磷酸盐转运蛋白(Na(+)-dependent phosphate cotransporter,Na-Pi)调节磷酸盐在生物体内的代谢和转运。本研究通过生物信息学分析和分子生物学试验获得了家蚕NaPi的同源基因BmNaPi,该基因位于家蚕8号染色体,编码区长1 437 bp,有10个外显子,编码478个氨基酸,预测蛋白序列在氨基末端含有一信号肽,序列中间有8个转膜结构域,与登录号为AAF57968、XP_001602874、EAA00281、XP_393759、XP_001950194等同源蛋白的一致性均在70%及以上。RT-PCR检测该基因在5龄3 d家蚕幼虫9种组织中的血液、体壁、生殖腺和头中表达,而中肠、丝腺、马氏管和脂肪体中没有表达。最后成功构建了该基因的酵母穿梭表达质粒pG-BKT7-BmNaPi。 展开更多

关键词 家蚕 BmNaPi 克隆 组织表达 酵母穿梭表达质粒

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大肠杆菌-分枝杆菌分泌型穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65的构建及人结核杆菌HSP65的表达 被引量：2

9

作者 戴五星 陈智浩 +4 位作者 高红 黄海浪 梁靓 程继忠 皇甫永穆 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期170-174,共5页

用PCR技术从BacillusCalmette gu啨ｒｉｎ(BCG)基因组中扩增出抗原 85B(Ag85B)的信号肽 (SP)DNA序列 ,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下... 用PCR技术从BacillusCalmette gu啨ｒｉｎ(BCG)基因组中扩增出抗原 85B(Ag85B)的信号肽 (SP)DNA序列 ,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建成分泌型原核穿梭表达质粒 (pBCG SP HSP65)。酶切鉴定、PCR和测序分析结果均表明分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP65构建成功。利用电穿孔将该质粒转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterialsmegmatis,MS)中 ,用卡那霉素筛选出阳性重组子。经热诱导后用SDS PAGE观察到在耻垢分枝杆菌中 65kD蛋白占总蛋白的 2 0 % ,而在重组耻垢分枝杆菌表达的 65kD蛋白占菌体总蛋白的 3 4 46% ,占裂解物上清总蛋白的 68 56% ,表明重组的HSP65基因能在耻垢分枝杆菌中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Western blot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合 ,说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性。 展开更多

关键词 大肠杆菌 分枝杆菌 分泌型穿梭表达质粒 信号肽 结核轩菌HSP65 人

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大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pY-α的构建

10

作者 赵宝华 杨虹 +1 位作者 许崇波 石振华 《河北师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2002年第2期187-189,共3页

利用分子生物学方法 ,以含人结核杆菌热休克蛋白 ( HSP) 70基因全长序列的质粒 p MT 70为模板 ,扩增出 hsp70启动子 ,将其定向克隆于 p UC 1 9,构建成重组质粒 p Y6 0 1 3;然后以重组质粒 p IJK 1为模板 ,扩增出分枝杆菌α信号肽基因并... 利用分子生物学方法 ,以含人结核杆菌热休克蛋白 ( HSP) 70基因全长序列的质粒 p MT 70为模板 ,扩增出 hsp70启动子 ,将其定向克隆于 p UC 1 9,构建成重组质粒 p Y6 0 1 3;然后以重组质粒 p IJK 1为模板 ,扩增出分枝杆菌α信号肽基因并将其克隆到 p Y6 0 1 3质粒中 hsp70启动子的下游 ,得到了大肠杆菌分枝杆菌表达质粒 p Y-α. 展开更多

关键词 hsp70启动子 α-信号肽 BCG穿梭表达质粒 大肠杆菌 分枝杆菌 pY-α 卡介苗

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大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因人白细胞介素-2在大肠杆菌和卡介苗中的表达

11

作者 汪谋岳 《中华医学信息导报》 1998年第1期18-18,共1页

据《中华结核和呼吸杂志》1997年12月20卷第6期报道 广州中医药大学第二附属医院曾星等,为构建和鉴定大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达质粒,检测外源基因在大肠杆菌和卡介苗中的表达。

关键词 卡介苗 人白细胞介素-2 肠杆菌 穿梭表达质粒 分支杆菌 外源基因 基因工程技术 聚丙烯酞胺凝胶电泳 白细胞介素一2 免疫吸附法

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