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RNA干扰技术建立人PARP-1缺陷细胞株 被引量：3
1
作者 沙焱 曾玉云 +5 位作者 庄志雄 何云 胡大林 胡恭华 杨建平 涂晓志 《卫生研究》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期650-652,共3页
目的建立并鉴定聚ADP核糖聚合酶1(hPARP1)缺陷细胞株,用于研究hPARP1基因的作用机制及其缺陷与DNA损伤发生的关系。方法将用已经构建的pEGFPC1shRNA(包含两个PARP1基因及一个阴性对照)转染支气管上皮细胞(16HBE),使之在16HBE中表达,转... 目的建立并鉴定聚ADP核糖聚合酶1(hPARP1)缺陷细胞株,用于研究hPARP1基因的作用机制及其缺陷与DNA损伤发生的关系。方法将用已经构建的pEGFPC1shRNA(包含两个PARP1基因及一个阴性对照)转染支气管上皮细胞(16HBE),使之在16HBE中表达,转染后命名为16HBEP1、16HBEP2及16HBEN。用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hPARP1基因的表达水平。结果pEGFPC1shRNA在真核细胞成功表达;16HBEP1和16HBEP2的蛋白表达水平分别下降了84.3%及63.7%。结论hPARP1缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hPARP1基因功能研究提供了一种有效手段。 展开更多
关键词 rna干扰 短发夹-rna hPARP1 绿色荧光蛋白栽体 真核细胞转染
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短发夹状RNA抑制survivin基因在肝癌细胞中的表达 被引量：14
2
作者 闫歌 黄爱龙 +5 位作者 唐霓 张秉强 蒲丹 向明确 兰英华 吴刚 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 2003年第12期712-715,共4页
目的 构建抗凋亡因子survivin的短发夹状RNA(shRNA),观察其在肝癌细胞株HepG2、SMMC—7721中对survivin基因表达的抑制作用。方法 设计、合成两对survivin编码基因的反向重复序列,中间分别间隔4和8个nt,分别定向克隆至载体pTZU6+1的U6... 目的 构建抗凋亡因子survivin的短发夹状RNA(shRNA),观察其在肝癌细胞株HepG2、SMMC—7721中对survivin基因表达的抑制作用。方法 设计、合成两对survivin编码基因的反向重复序列,中间分别间隔4和8个nt,分别定向克隆至载体pTZU6+1的U6转录启动子下,构建pshRNA—survivin 1和pshRNA—survivin 2重组质粒,与表达survivin基因的质粒pEGFP—C1-survivin共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC—7721,荧光显微镜下观察融合蛋白中GFP的表达以分析pshRNA—survivin对survivin基因表达的抑制作用。结果 酶切分析和测序证实pshRNA—survivin 1和pshRNA—survivin 2构建成功;两组shRNA对survivin的表达均有明显的抑制作用,抑制率达80％以上;两重组质粒在HepG2和SMMC—7721两种细胞中抑制目的基因的作用无明显差异;反向重复序列中间隔4或8个nt构建的shRNA,对抑制目的基因的表达无显著差异。结论 构建的pshRNA—survivin重组质粒能有效抑制survivin基因在肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721中的表达。 展开更多
关键词 短发夹状rna SURVIVIN基因 肝癌 癌细胞 细胞凋亡 基因治疗
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Ki67基因短发夹状RNA表达载体对肾癌细胞生长的抑制作用 被引量：15
3
作者 郑骏年 陈家存 +8 位作者 孙晓青 郑典宝 曹敬毅 温儒民 王军起 刘俊杰 史启铎 韩瑞发 马腾骧 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期744-746,共3页
目的研究针对Ki67基因的短发夹状RNA(shRNA)表达载体pSilencer-Ki67对人肾癌细胞生长的抑制作用。方法将pSilencer-Ki67转染人肾癌786-0细胞,24、48、72、120、144 h后分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Ki67 m... 目的研究针对Ki67基因的短发夹状RNA(shRNA)表达载体pSilencer-Ki67对人肾癌细胞生长的抑制作用。方法将pSilencer-Ki67转染人肾癌786-0细胞,24、48、72、120、144 h后分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Ki67 mRNA、蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,原位末端标记法检测细胞凋亡。结果pSilencer-Ki67转染后48 h 786-0细胞Ki67mRNA表达(34．1±1．7)%、蛋白表达(42．6±1．7)%降低最明显,与空质粒对照组[(97．7±0．9)%、(97．3±1．6)%]比较差异均有统计学意义(P＜0．01)。pSilencer-Ki67处理后48 h细胞增殖抑制率(76．7±3．2)%最高,72 h凋亡细胞阳性率(74．3±5．9)%最高,与空质粒对照组[(7．0±0．5)%、(8．4±1．1)%]比较差异有统计学意义(P＜0．01)。pSilencer-Ki67的这些作用可持续144 h。结论pSilencer-Ki67能有效、持续抑制人肾癌786-0细胞生长,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。 展开更多
关键词 肾癌 短发夹状rna 质粒 基因治疗
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RNA干扰真核表达载体pEGFP-H1介导的血管内皮生长因子shRNA治疗人胶质瘤的实验研究 被引量：10
4
作者 姜晓兵 赵洪洋 +3 位作者 周凤 刘如恩 张方成 赵甲山 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期547-550,共4页
目的　构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(pEGFPH1 /VEGF),观察其在体内和体外对胶质瘤细胞株U251生长的抑制作用。方法　应用PCR构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP- H1,并利用该载体介... 目的　构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(pEGFPH1 /VEGF),观察其在体内和体外对胶质瘤细胞株U251生长的抑制作用。方法　应用PCR构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP- H1,并利用该载体介导VEGFshRNA。用阳离子脂质体转染U251细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP的表达,用RT- PCR检测VEGFmRNA的表达,以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养液中VEGF蛋白的含量。同时筛选转染pEGFP- H1和pEGFP- H1 /VEGF的U251稳定细胞株,制备裸鼠U251细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况。结果　与空载体转染组相比, pEGFP- H1 /VEGF对VEGF的抑制率达77. 9%。对照组和pEGFP -H1组裸鼠肿瘤重量分别为1 .7g±0 4g和1 .5g±0 .7g,体积分别为1573mm3 ±330mm3 和1430mm3 ±382mm3,两组之间重量和体积差异均无统计学意义(P>0 .05 ),而pEGFP- H1 /VEGF组肿瘤重量为0 .5g±0 .4g,体积为401mm3 ±272mm3,与对照组比较差异有统计学意义(P<0. 01)。结论　pEGFP H1介导的VEGFshRNA能有效抑制U251细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长。 展开更多
关键词 VEGF EGFP 血管内皮生长因子 肿瘤 介导 治疗 真核表达载体 U251细胞 rna干扰 短发夹环rna
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短发夹状RNA在人细胞诱导RNA干扰(英文) 被引量：7
5
作者 陈扬超 宋超 罗超权 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第6期566-570,共5页
背景与目的:RNA干扰是一种通过细胞内导入双链RNA而导致特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前RNA干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状RNA(shorthairpinRNAs,shRNA),通过这些s... 背景与目的:RNA干扰是一种通过细胞内导入双链RNA而导致特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前RNA干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状RNA(shorthairpinRNAs,shRNA),通过这些shRNA来诱导RNA干扰(RNAinterference,RNAi),为基因功能分析提供新的实验手段。方法:利用双荧光素酶报告系统来检测DNA载体在细胞内产生的shRNA诱导RNAi的效果。比较该载体产生的shRNA在不同条件下的RNA干扰效果。结果:DNA载体产生的shRNA在人细胞能诱导RNAi,序列特异地抑制基因表达。抑制效果与所选基因靶位点高度相关。结论:shRNA在人细胞能诱导RNA干扰,序列特异地抑制基因表达,这一方法可用于基因功能分析。 展开更多
关键词 短发夹状rna rna干扰 DNA载体 双荧光素酶报告系统 基因表达 细胞生物学
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bcl-x_L短发夹状RNA诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡(英文) 被引量：8
6
作者 何承伟 刘芳 +2 位作者 张月飞 梁统 周克元 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第6期646-652,共7页
背景与目的:实验证明bcl-xL 在鼻咽癌细胞株CNE-2Z 中存在高表达,它可能在鼻咽癌的发生发展、转移及治疗过程中产生耐药等方面发挥重要作用。本研究拟探讨bcl-xL 短发夹状RNA (shorthairpin RNA ,shRNA )诱导CNE-2Z 细胞凋亡的作用。方... 背景与目的:实验证明bcl-xL 在鼻咽癌细胞株CNE-2Z 中存在高表达,它可能在鼻咽癌的发生发展、转移及治疗过程中产生耐药等方面发挥重要作用。本研究拟探讨bcl-xL 短发夹状RNA (shorthairpin RNA ,shRNA )诱导CNE-2Z 细胞凋亡的作用。方法:把表达bcl-xL shRNA 的重组质粒pm U6-RNAi转染到CNE-2Z细胞中,用荧光染色和流式细胞术等方法检测细胞凋亡;用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polym erase chain reaction,RT-PCR )检测bcl-xL、bcl-2、survivin和caspase-3的m RNA 表达水平;用W estern blot检测Bcl-xL、Caspase-3和P53的蛋白表达水平。结果:流式细胞术检测发现,pm U6-RNAi重组质粒作用24h 后,细胞出现明显的凋亡峰;H oechst33258单染在荧光显微镜下可见细胞缩小、染色质固缩和核断裂;RT-PCR 分析pm U6-RNAi重组质粒作用细胞后明显下调了bcl-xL、bcl-2和caspase-3的m RNA 表达水平, 对survivin 的m RNA 表达水平无影响;W estern blot分析pm U6-RNAi质粒作用细胞后明显下调了Bcl-xL、Caspase-3的蛋白表达水平,而大幅度上调了P53的蛋白表达水平。结论:bcl-xL shRNA 可诱导CNE-2Z 细胞凋亡;CNE-2Z 细胞的凋亡可能与bcl-2、caspase-3和p53有着密切的关系;质粒表达的bcl-xL shRNA 展开更多
关键词 鼻咽肿瘤 短发夹状rna BCL-XL 细胞凋亡
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联合基因Survivin、CDK1的shRNAs靶向干扰对鼻咽癌CNE-2细胞增值的影响 被引量：11
7
作者 陈淑萍 周红桃 +3 位作者 蔡俊宏 王福利 许茂轩 符生苗 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期239-247,共9页
为了构建具有干扰效应的靶向Survivin和CDK1基因及两者串联的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体,并研究其靶向干扰对鼻咽癌细胞CNE-2生物学行为的改变。本研究通过构建pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA... 为了构建具有干扰效应的靶向Survivin和CDK1基因及两者串联的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体,并研究其靶向干扰对鼻咽癌细胞CNE-2生物学行为的改变。本研究通过构建pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA重组载体,用脂质体Lipofectamine 2000法将其转染入CNE-2细胞株中,应用RT-PCR方法初步筛选具有干扰效应的重组载体,逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Survivin、CDK1 mRNA的基因表达水平,Western blot检测Survivin和CDK1蛋白表达以及噻唑蓝溴化四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测癌细胞增殖活性的变化。结果表明:成功构建具有干扰效应的shRNAs表达载体;联合或单基因Survivin、CDK1的shRNAs表达载体干扰CNE-2细胞后,其对应的mRNA和目的蛋白表达均降低,CNE-2癌细胞增殖活性降低,联合基因shRNAs表达载体具有一定程度的干扰增强作用。 展开更多
关键词 短发夹样rna Survivin基因 CDK1基因 鼻咽癌 CNE-2
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AAV载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达 被引量：7
8
作者 马鑫 鲁晓春 +6 位作者 彭建强 谭淑萍 袁振华 尹芳 王宏 吴小兵 侯云德 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期253-255,共3页
目的　构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK 2 1细胞中抑制荧光素酶的表达。方法　从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6snRNA启动子 ,接以被 9bp序列间隔的 2 1bp荧光素酶靶序列的反向重复序列 ,置于AAV载体质粒pSNAV中 ,构建成荧光素酶短... 目的　构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK 2 1细胞中抑制荧光素酶的表达。方法　从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6snRNA启动子 ,接以被 9bp序列间隔的 2 1bp荧光素酶靶序列的反向重复序列 ,置于AAV载体质粒pSNAV中 ,构建成荧光素酶短发夹环RNA(shRNA)产生质粒pSNAV U6 Luc。与pMAMneoLuc质粒共转染BHK 2 1细胞 ,检测其对荧光素酶表达的影响。并且单独转染荧光素酶细胞株 ,检测其抑制荧光素酶表达的效果。结果　pSNAV U6 Luc对共转染的pMAMneoLuc中荧光素酶的表达抑制 5 0 % ,而对荧光素酶细胞株中荧光素酶的表达抑制 70 %。结论　实验表明荧光素酶shRNA产生质粒能够有效抑制荧光素酶在BHK 2 1细胞中的表达。 展开更多
关键词 AAV载体 质粒介导 荧光素酶 短发夹环rna 哺乳动物 基因表达
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RNA干扰体外抑制人食管鳞癌细胞Eca-109缺氧诱导因子-1α的表达 被引量：5
9
作者 肖斌 施瑞华 +5 位作者 杜琰萍 朱宏 凌亭生 张国新 林艳 郝波 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2006年第17期1654-1661,共8页
目的:观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人食管鳞癌细胞系Eca-109中 HIF-1α基因的沉默效应,筛选有效干扰靶点．方法:设计合成干扰缺氧诱导因子-1α RNA 寡核苷酸片段... 目的:观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人食管鳞癌细胞系Eca-109中 HIF-1α基因的沉默效应,筛选有效干扰靶点．方法:设计合成干扰缺氧诱导因子-1α RNA 寡核苷酸片段,经退火、连接等步骤克隆至线性化的PGCsi真核表达载体上,测序鉴定．应用LipofectamineTM2000将该质粒分别转染Eca-109细胞和293T细胞,其中Eca-109抗性细胞又经2-4 wk的G418筛选．荧光显微镜评估转染效率,荧光定量RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达情况,western blot检测HIF-1α蛋白表达情况．结果:成功构建了3个靶点的重组质粒pGCsi- H1-shHIF,293T细胞平均转染效率为约85．4％, Eca-109细胞的平均转染效率约73．2％．荧光定量RT-PCR和Western blot显示瞬时转染这3种重组质粒的293T细胞和筛选2 wk的Eca-109 细胞HIF-1 α mRNA和蛋白表达均较对照组有不同程度的下降,其中2号和3号靶点的干扰效应尤为明显．在瞬时转染72 h后的293T 细胞中,其抑制率分别达到了78．5％、86．9％ (P=0．000,P=0．000 vs 72 h空白对照组),筛选2 wk的Eca-109细胞中,3号靶点对HIF-1α mRNA的抑制率也达到了69．7％(P=0．000 vs 2 wk空白对照组)．结论:重组质粒pGCsi-shHIF能有效抑制食管鳞癌细胞Eca-109中HIF-1α基因的表达,经不同细胞中的瞬时和稳定转染筛选出了有效干扰靶位． 展开更多
关键词 食管鳞癌 缺氧诱导因子-1Α rna干扰 短发夹状rna
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shRNA转染对异位内膜细胞survivin基因的靶点抑制作用 被引量：9
10
作者 彭冬先 何援利 丘立文 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期859-862,866,共5页
目的构建靶向人survivin基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,观察其对异位内膜细胞survivin基因的抑制作用。方法设计干扰人survivin基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pGCL-GFP载体,PCR鉴定和测序分析及阳性克隆质粒抽提... 目的构建靶向人survivin基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,观察其对异位内膜细胞survivin基因的抑制作用。方法设计干扰人survivin基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pGCL-GFP载体,PCR鉴定和测序分析及阳性克隆质粒抽提,在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和survivin基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度。感染人异位子宫内膜细胞,采用RT-PCR测定细胞中survivin mRNA的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较。结果慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为8×108U/ml。Survivin shRNA慢病毒载体感染人异位内膜细胞后,Survivin mRNA水平为0.15±0.03,明显低于阴性对照组0.42±0.06和空白对照组0.48±0.08(P<0.01);而阴性对照组与空白对照组相比无统计学差异。结论成功构建针对survivin基因的shRNA慢病毒载体,体外感染人异位内膜细胞后可有效抑制survivin基因的表达,为研究子宫内膜异位症分子病因和基因治疗提供了新的平台。 展开更多
关键词 SURVIVIN基因 短发夹状rna 慢病毒 异位内膜细胞 子宫内膜异位症
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血管紧张素Ⅱ1型受体短发夹环RNA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 被引量：6
11
作者 孙成林 段志泉 +4 位作者 辛世杰 冯宗承 张京红 张令宇 张强 《中国应用生理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期263-267,共5页
目的 :RNA干扰 (RNAi)是一种新的高效特异地阻断基因表达的基因阻断技术。本研究旨在探讨血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1R)的短发夹环RNA质粒 (pAT1R shRNA)对大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的影响。 方法 :构建pAT1R shRNA质粒 ,并转染入鼠... 目的 :RNA干扰 (RNAi)是一种新的高效特异地阻断基因表达的基因阻断技术。本研究旨在探讨血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1R)的短发夹环RNA质粒 (pAT1R shRNA)对大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的影响。 方法 :构建pAT1R shRNA质粒 ,并转染入鼠VSMC中 ,应用RT PCR及Westernblot检测血管平滑肌细胞AT1R的mRNA和蛋白表达的变化 ,验证 pAT1R shRNA是否具有RNAi作用 ;应用台盼蓝染色法和MTT法检测VSMC增殖情况。结果 :构建的质粒 pAT1R shRNA经测序鉴定验证与预期相符。转染组AT1R的mRNA和蛋白表达明显减少 ,与对照组相比有显著性差异 (P <0 .0 1) ;转染质粒同时加AngⅡ刺激的VSMC增生明显受到抑制 ,与对照组相比有显著性差异 (P <0 .0 1)。结论 :构建的pAT1R shRNA质粒具有RNAi作用 。 展开更多
关键词 rna干扰 血管紧张素Ⅱ1型受体 短发夹环rna 细胞增殖
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核干细胞因子特异性短发夹状RNA对HL-60细胞分化抗原和生物学性质的影响 被引量：7
12
作者 岳保红 朱晓燕 +6 位作者 张功员 孙玲 赵小强 王清霞 刘帅 张秋堂 张钦宪 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期1191-1194,共4页
目的研究核干细胞因子(nuc leostem in,NS)特异性短发夹状RNA(shRNA)阻断NS基因表达对HL-60白血病细胞分化抗原及生物学性质的影响,探讨NS的生物学功能和与急性白血病的关系以及用于基因治疗的可能性。方法特异性转染试剂和合成的NS短... 目的研究核干细胞因子(nuc leostem in,NS)特异性短发夹状RNA(shRNA)阻断NS基因表达对HL-60白血病细胞分化抗原及生物学性质的影响,探讨NS的生物学功能和与急性白血病的关系以及用于基因治疗的可能性。方法特异性转染试剂和合成的NS短发夹状RNA(NS-shRNA)体外直接转染HL-60细胞,采用RT-PCR判断基因阻断效果,MTT法测定转染后细胞增殖能力,流式细胞仪(FCM)测定细胞分化抗原,形态学观察细胞形状和生长状态,血细胞分析仪测定细胞大小、粒度。结果合成的2条NS-shRNA均能明显阻断NS基因表达,抑制率分别为37.82%和71.88%;NS-shRNA能显著抑制HL-60细胞的增殖并存在时间和浓度依赖性,以48 h和10 nmol/L浓度最佳。转染后:分化抗原CD11b、CD33、CD14、CD64、HLA-DR增高,CD38降低,显示有向粒系继续成熟和向单核系重新分化趋势;细胞聚团性减弱,碎片增多,一部分细胞形态变成梭形和长尾形,染色后细胞核紧密,凹陷,髓过氧化物酶(MPO)和α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)活性增强;大小和粒度分析小体积细胞和核碎裂细胞增多。结论NS-shRNA通过阻断NS基因表达,对HL-60细胞有抑制增殖和促分化作用,改变了细胞的生物学性质,使细胞恶性程度有所减弱,并有可能诱发凋亡,在白血病的基因中具有潜在的临床价值。 展开更多
关键词 核干细胞因子 短发夹状rna 分化抗原 生物学性质 增殖 分化 HL-60细胞
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沉默FBI-1基因对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响 被引量：7
13
作者 陈茂剑 王丽 +4 位作者 杨伟萍 覃庆洪 谭启杏 练斌 韦长元 《生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期497-503,共7页
本研究旨在观察短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)介导的人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子1 (FBI-1)基因沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。用qRT-PCR和Western blot分别检测FBI-1、Bcl-2、Bax、cleaved-Ca... 本研究旨在观察短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)介导的人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子1 (FBI-1)基因沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。用qRT-PCR和Western blot分别检测FBI-1、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3和Survivin的mRNA和/或蛋白的表达水平;采用shRNA干扰技术沉默MDA-MB-231细胞中FBI-1基因的表达;用CCK-8法以及克隆形成实验检测细胞增殖;用流式细胞术检测细胞凋亡;用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞的成瘤能力。结果显示,MDA-MB-231细胞的FBI-1 mRNA和蛋白的表达水平明显高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A;经shRNA靶向沉默FBI-1基因表达后,细胞增殖能力明显降低,细胞凋亡率显著增高,伴随Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下调、Bax蛋白表达显著上调和Caspase 3活化,MDA-MB-231细胞的裸鼠皮下成瘤能力受抑制。以上结果提示,靶向沉默FBI-1基因表达可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导细胞凋亡并抑制细胞的裸鼠皮下成瘤能力。 展开更多
关键词 FBI-1 短发夹状rna 三阴性乳腺癌 细胞增殖 细胞凋亡
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RNA干扰caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用 被引量：6
14
作者 陈栋 张艳 +3 位作者 朱珉 陈刚 张伟杰 陈实 《实用医学杂志》 CAS 2008年第3期338-341,共4页
目的:探讨RNA干扰caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠caspase-8基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-caspase-8shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定表达caspase-8s... 目的:探讨RNA干扰caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠caspase-8基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-caspase-8shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定表达caspase-8shRNA的细胞系。实验分为3组,(1)正常对照组,未转染的RK3E细胞;(2)阴性对照组,转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;(3)实验组,转染caspase-8shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖孵育12h后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR和RealtimePCR检测mRNA的表达,以及各组caspase-8蛋白的活性。结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P<0.01),caspase-8的mRNA水平和蛋白活性显著降低(P<0.01)。结论:针对caspase-8的特异性shRNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制细胞凋亡的发生。 展开更多
关键词 基因沉默 细胞凋亡 短发夹状rna CASPASE-8
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MDR1短发夹RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究 被引量：4
15
作者 胡礼仪 张有顺 +5 位作者 周新 张吉发 袁房均 黄玲 王菊 戴宗晴 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期542-545,共4页
目的　构建在哺乳动物细胞中表达MDR1短发夹RNA(shorthairpinRNA ,shRNA)的表达质粒 ,并初步探讨其对耐药肝癌细胞MDR1mRNA的抑制作用及抗肿瘤药物耐药性的影响。方法　根据Genbank中MDR1mRNA设计的两条多聚核苷酸序列 ,退火形成双链DN... 目的　构建在哺乳动物细胞中表达MDR1短发夹RNA(shorthairpinRNA ,shRNA)的表达质粒 ,并初步探讨其对耐药肝癌细胞MDR1mRNA的抑制作用及抗肿瘤药物耐药性的影响。方法　根据Genbank中MDR1mRNA设计的两条多聚核苷酸序列 ,退火形成双链DNA ,再与经双酶切后的载体PGE 1连接 ,构建 pshRNA MDR1重组质粒 ,在脂质体的介导下转染肝癌细胞株BEL 74 0 2 /ADM ,RT PCR分析MDR1mRNA的表达 ,MTT法检测阿霉素对细胞的半数抑制浓度 (IC50 )。结果　PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功 ,并能明显地抑制BEL 74 0 2 /ADMMDR1mRNA的表达 ,对阿霉素的耐药指数降低了17.5倍 ( 2 99.2 / 17.1)。结论　构建的 pshRNA MDR1表达质粒能有效地抑制转染细胞MDR1mRNA ,从而提高肿瘤细胞的药物敏感性。 展开更多
关键词 多药耐药 MDR1 Mrna 短发夹状rna rna干扰 BEL-7402/ADM细胞
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RNA干扰技术在抗乙型肝炎病毒感染应用中的研究进展 被引量：5
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作者 孔令波 佟立新 王锡育 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2009年第13期1324-1328,共5页
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术能够特异性地降低目的基因的表达,是目前最有效的基因沉默技术,体内外研究均证实了RNAi在抗乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)感染中的作用.近年来,为使RNAi更适应抗HBV感染临床应用的需要,许多学... RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术能够特异性地降低目的基因的表达,是目前最有效的基因沉默技术,体内外研究均证实了RNAi在抗乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)感染中的作用.近年来,为使RNAi更适应抗HBV感染临床应用的需要,许多学者针对小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶序列、转导方法、短发夹状RNA(shorthairpin RNA,shRNA)载体、各种联合策略的选择及化学修饰的应用等方面进行了大量研究.本文综述RNAi技术,尤其是HBV特异shRNA在抗HBV感染中应用的研究进展. 展开更多
关键词 rna干扰 乙型肝炎病毒 小分子干扰rna 短发夹状rna
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Livin基因短发夹状RNA对子宫颈癌Siha细胞增殖迁移的影响 被引量：7
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作者 于利利 吴莉英 +2 位作者 蔡晶 黄在菊 王泽华 《中华妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期538-540,共3页
Livin基因作为近年来发现的一种人类凋亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosisprotein，IAP），低表达于健康成人组织和胚胎组织中，而高表达于包括黑色素瘤、淋巴瘤、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌等^[1-3]多种类型的肿瘤组织中。
关键词 LIVIN基因 子宫颈癌 短发夹状rna 细胞增殖 SIHA 迁移 凋亡抑制蛋白 胚胎组织
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短发夹状RNA干扰窖蛋白-1表达对人肝细胞增殖的影响 被引量：6
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作者 任刚 刘英 +2 位作者 王孝敏 赵春晖 邹伟 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期379-382,共4页
目的 探讨体外下调窖蛋白-1（Cav-1）的表达对人肝细胞增殖的影响。方法构建Cav-1特异性短发夹状RNA（shRNA）表达载体psiRNA—CAV1，转染人正常肝细胞系（CHL），抗菌素Zeocin筛选单克隆细胞株，建立Cav-1低表达的人肝细胞模型（CAV7... 目的 探讨体外下调窖蛋白-1（Cav-1）的表达对人肝细胞增殖的影响。方法构建Cav-1特异性短发夹状RNA（shRNA）表达载体psiRNA—CAV1，转染人正常肝细胞系（CHL），抗菌素Zeocin筛选单克隆细胞株，建立Cav-1低表达的人肝细胞模型（CAV7）。四甲基偶氮唑盐法检测Cav-1下调对肝细胞增殖的影响，Westernblot检测Erk1／2和Akt等增殖生长相关信号蛋白表达和活性的变化。结果正常肝细胞有高水平的Cav-1表达，稳定转染psiRNA—CAVI后，Cav1表达减少约70％；Cav-1表达下调后，肝细胞的增殖先变快（24h和72h，P〈0．05；96h，P〈0．01），后减慢；增殖相关蛋白P—Akt和P—Erk／2的表达减少，即Akt和Erk1/2两条通路受到抑制。结论Cav-1可能在正常肝细胞的增殖中起重要作用。 展开更多
关键词 肝细胞 窖蛋白-1 短发夹状rna
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survivin短发夹状RNA真核表达载体的构建及其对宫颈癌细胞survivin表达的影响 被引量：6
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作者 宋晖 辛晓燕 +3 位作者 肖锋 王德堂 岳乔红 郭会玲 《医学研究生学报》 CAS 2008年第8期795-799,I0001,共6页
目的:构建survivin基因短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其对宫颈癌细胞survivin表达的抑制作用。方法:设计、合成2对survivin特异性微小片段RNA引物(s1、s2),退火连接后利用DNA重组技术,将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1... 目的:构建survivin基因短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其对宫颈癌细胞survivin表达的抑制作用。方法:设计、合成2对survivin特异性微小片段RNA引物(s1、s2),退火连接后利用DNA重组技术,将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1-U6 neo,酶切、鉴定测序后,经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达,Western blot检测survivin蛋白表达。结果:成功构建了survivin shRNA真核表达载体pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2,G418筛选24 d后出现阳性克隆,转染pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2的HeLa细胞中,survivin表达呈现不同程度下调,pSilencer2.1-s2的干涉效果较好。结论:成功构建并筛选出干涉效果较好的survivin shRNA真核表达载体,为进一步研究其对宫颈癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。 展开更多
关键词 SURVIVIN 短发夹状rna 真核表达载体 宫颈肿瘤
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靶向Pokemon基因shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞生长的影响 被引量：6
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作者 王波 张全乐 +3 位作者 晏维 夏丽敏 刘梅 田德安 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2009年第30期3128-3133,共6页
目的:观察携带shRNA的重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响,并初步探讨其分子机制.方法:设计3对针对Pokemon基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体,脂质体介导转染肝癌细胞株HepG2细胞.RT-PCR及Western blot检测转染前后Pokemon m... 目的:观察携带shRNA的重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响,并初步探讨其分子机制.方法:设计3对针对Pokemon基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体,脂质体介导转染肝癌细胞株HepG2细胞.RT-PCR及Western blot检测转染前后Pokemon mRNA及蛋白质的表达,MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖及凋亡的变化,RT-PCR检测其可能的下游因子β-catenin及H-ras的表达.结果:成功构建含shRNA片段的重组质粒,依次命名为pshRNA1、2、3.转染HepG2细胞后,Pokemon基因的mRNA及蛋白质表达水平明显下调,以pshRNA2最强,抑制率分别为75.2%(RNA水平)和72.61%(蛋白质水平).MTT显示pshRNA2可明显抑制细胞增殖;流式细胞仪测定转染后细胞凋亡增加;RT-PCR显示下游因子H-ras的表达明显降低(P<0.05),而β-catenin的表达没有变化(P>0.05).结论:采用RNAi技术可以特异性阻断Pokemon基因的表达;Pokemon基因有促进肝癌细胞株增殖及抑制其凋亡的作用,该效应可能与下调其下游因子H-ras的表达有关. 展开更多
关键词 POKEMON 短发夹状rna 细胞增殖 细胞凋亡 H-RAS
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