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抑制MDR1基因表达shRNA RNAi系统的构建 被引量：4
1
作者 秦维超 张有顺 +2 位作者 周新 胡礼仪 黄玲 《山东医药》 CAS 北大核心 2005年第13期19-20,共2页
目的构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统。方法根据MDR1基因已知序列,设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列,合成两对62nt并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHI和XbaI双酶切后线性P... 目的构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统。方法根据MDR1基因已知序列,设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列,合成两对62nt并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHI和XbaI双酶切后线性PGE-1载体的U6启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒。结果对重新构建的pshRNA-MDR1载体经PCR扩增后行电泳分析,并对含有插入基因片段行测序分析。结果表明,62个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全一致。结论载体的成功构建为研究其对MDR1基因表达的抑制作用打下基础,同时使我们发展了在体内合成siRNA的方法。 展开更多
关键词 多药耐药基因 MDR1 短发夹 RNA干扰 真核表达载体 肿瘤细胞
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hWAPL基因shRNA真核表达载体的构建及干扰效果的初步鉴定 被引量：5
2
作者 曹利仙 潘巍巍 +2 位作者 黄玉蓉 张欣怡 康燕琴 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期446-450,共5页
目的：构建针对人半翼基因（hWAPL）的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,并观察其转染效率.方法：根据hWAPL基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到带有卡那抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序... 目的：构建针对人半翼基因（hWAPL）的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,并观察其转染效率.方法：根据hWAPL基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到带有卡那抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序后,用脂质体转染到CasKi细胞中,观察荧光表达,鉴定转染效率.RT-PCR检测结果表明,筛选到的短链hWAPL siRNA能有效抑制内源hWAPL的表达.结果：成功构建了表达shRNA的质粒及其阴性对照质粒,转染到CasKi细胞系中可以特异下调hWAPL mRNA表达,载体转染效率达50%以上.结论：RNAi能特异地下调CasKi细胞中hWAPL mRNA含量,抑制宫颈癌细胞恶性增殖,提示hWAPL可能成为宫颈癌基因治疗的一个新的靶点. 展开更多
关键词 人半翼基因 短发夹 RNA 细胞转染
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短发夹RNA干扰表达质粒逆转人大肠癌细胞LOVO/5-Fu多药耐药的研究 被引量：3
3
作者 王开雷 李乐平 靖昌庆 《中国现代普通外科进展》 CAS 2010年第11期844-848,共5页
目的:探讨短发夹RNA(shRNA)沉默多药耐药MDR)基因对大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu生长的影响。方法:构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu,MTT法检测各组细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞术检测细胞周期变化... 目的:探讨短发夹RNA(shRNA)沉默多药耐药MDR)基因对大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu生长的影响。方法:构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu,MTT法检测各组细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白(P-gp)的表达,Realtime-PCR检测各组细胞MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化。结果:与对照组质粒组和未转染组相比,转染含shRNA干扰质粒细胞的实验组IC50明显降低,为(2.304±0.232)μmol/L,且差异有统计学意义(P<0.05),敏感性的相对逆转率为73.8%;凋亡率明显升高为(5.767±0.694)%(P<0.05);MDR1 mRNA表达明显下调(P<0.05);P-gp的表达水平降低(P<0.05)。结论:靶向MDR1的shRNA干扰质粒有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,从而增强了LOVO/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,有可能为临床上克服大肠癌化疗过程中出现的耐药提供新的作用靶点和治疗途径。 展开更多
关键词 结直肠肿瘤 细胞凋亡 短发夹 RNA 多药耐药性 P 糖蛋白
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NogoB-shRNA表达质粒的构建及其在大鼠原代肝星状细胞收缩中的作用 被引量：1
4
作者 文茂瑶 门若庭 +2 位作者 但雪莲 吴文超 杨丽 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期362-366,350,共5页
目的构建针对大鼠NogoB基因的shRNA表达质粒,并初步探究其在大鼠肝星状细胞(HSCs)收缩功能中的作用。方法设计并合成针对大鼠NogoB基因3个不同位点的shRNA,通过DNA重组技术,将shRNA插入pSuper质粒中,构建NogoB-shRNA重组质粒,转染至大... 目的构建针对大鼠NogoB基因的shRNA表达质粒,并初步探究其在大鼠肝星状细胞(HSCs)收缩功能中的作用。方法设计并合成针对大鼠NogoB基因3个不同位点的shRNA,通过DNA重组技术,将shRNA插入pSuper质粒中,构建NogoB-shRNA重组质粒,转染至大鼠原代肝星状细胞(HSCs)中,并通过Realtime PCR技术检测基因的相对表达量,筛选出能沉默大鼠NogoB基因的重组质粒,再通过Western blot加以验证,同时观察NogoB基因被抑制后,HSCs中内皮素1(Endothelin-1,ET-1)受体A、受体B(ETA、ETB)表达水平的变化。结果构建的3对重组质粒中,NogoB-shRNA2对NogoB的基因的表达具有明显的抑制作用。NogoB基因被抑制后,大鼠HSCs中ETA的表达无明显变化,ETB的表达升高,ETA/ETB的水平降低。结论成功构建了有效、特异的抑制大鼠NogoB基因表达的shRNA表达质粒,并初步观察到NogoB在肝星状细胞的收缩中可能有一定作用。 展开更多
关键词 短发夹 RNA NogoB 肝星状细胞
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靶向人BRG1基因的慢病毒载体构建及效率验证 被引量：1
5
作者 王树伟 王杨 +4 位作者 谈梦伟 袁扬 龚德军 韩林 徐志云 《国际心血管病杂志》 2014年第4期264-267,共4页
目的:构建靶向人BRG1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并验证其沉默效率。方法:设计3个针对人BRG1基因的特异性shRNA序列(shBRG1),构建于pLKO.1慢病毒载体中,并与psPAX2和pMD2.G质粒共同转染293T细胞以包装成慢病毒颗粒。将包装好的慢... 目的:构建靶向人BRG1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并验证其沉默效率。方法:设计3个针对人BRG1基因的特异性shRNA序列(shBRG1),构建于pLKO.1慢病毒载体中,并与psPAX2和pMD2.G质粒共同转染293T细胞以包装成慢病毒颗粒。将包装好的慢病毒感染人主动脉平滑肌细胞(HASMC),应用实时荧光定量PCR和western blot检测BRG1 mRNA和蛋白表达水平,判断其沉默效率。结果:3种shBRG1干扰序列均成功插入慢病毒载体中且测序正确,3种慢病毒均可有效降低BRG1 mRNA表达水平(P均<0.01)。其中shBRG1-3的沉默效率最高,其感染HASMC后BRG1蛋白表达水平较对照组显著下降(P<0.01)。结论:靶向人BRG1基因的shRNA慢病毒表达载体构建成功,shBRG1-3慢病毒能够有效降低BRG1 mRNA和蛋白表达水平。 展开更多
关键词 BRG1 短发夹 RNA 慢病毒载体 主动脉平滑肌细胞
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靶向表皮生长因子受体基因的短发夹RNA对肺腺癌A549细胞生长及药物敏感性的影响
6
作者 白莉 余祖滨 +3 位作者 祝蓉 张新 高磊 白春学 《中华肺部疾病杂志（电子版）》 CAS 2007年第1期12-15,共4页
目的探讨瞬时转染靶向表皮生长因子受体(EGFR)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体对肺腺癌A549细胞生长及药物敏感性的影响。方法构建靶向EGFR的shRNA载体(pShEGFR)和非特异性的shRNA载体(pShNEG),阳离子脂质体将其转染至肺腺癌A549细胞,... 目的探讨瞬时转染靶向表皮生长因子受体(EGFR)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体对肺腺癌A549细胞生长及药物敏感性的影响。方法构建靶向EGFR的shRNA载体(pShEGFR)和非特异性的shRNA载体(pShNEG),阳离子脂质体将其转染至肺腺癌A549细胞,免疫荧光和Western blot法检测转染后细胞中EGFR蛋白表达变化;克隆形成实验观察细胞生长变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;MTI法检测细胞对顺铂、阿霉素、泰素的敏感性。结果与未转染组和pShNEG转染组细胞相比,pShEGFR可显著抑制A549细胞中EGFR蛋白表达,转染后第6天抑制率达74.1%(P<0.01);pShEGFR转染组细胞克隆形成抑制率为62.8%。与未转染组和pShNEG组相比,pShEGFR组细胞阻滞在G_0/G_1期(P<0.01),凋亡细胞比例显著增加(P<0.01);与未转染组相比,pShEGFR可将A549细胞对顺铂、阿霉素、泰素的敏感性分别提高6.7、5.5、6.6倍。结论瞬时转染靶向EGFR基因的shRNA表达载体能够通过下调EGFR蛋白水平抑制肺腺癌A549细胞生长,并提高细胞对不同化疗药物的敏感性。 展开更多
关键词 表皮生长因子 短发夹 RNA 肺肿瘤 抗药性
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乙酰化酶基因 RNA 干扰文库的构建及其对 HepG2．2．15细胞的感染
7
作者 李凤棣 刘柯慧 +6 位作者 吴海清 汤伟亮 赵钢德 项晓刚 徐玉敏 谢青 王晖 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期649-652,共4页
目的：构建人类基因组中16个组蛋白乙酰化酶的短发夹 RNA（shRNA）慢病毒载体文库，为进一步探索表观遗传学基因在 HBV 调控中的作用机制提供有利工具。方法根据 shRNA 引物设计原则，针对每个基因选择8对确保干扰效率的 shRNA 序列（A... 目的：构建人类基因组中16个组蛋白乙酰化酶的短发夹 RNA（shRNA）慢病毒载体文库，为进一步探索表观遗传学基因在 HBV 调控中的作用机制提供有利工具。方法根据 shRNA 引物设计原则，针对每个基因选择8对确保干扰效率的 shRNA 序列（A～H），将引物退火后连接至 shRNA空慢病毒载体上转化，PCR 法验证菌落克隆，确认阳性克隆；对质量合格的质粒再进行单切酶验证。分别将同一基因的4个 shRNA 慢病毒质粒混合，分别包装病毒。293T 细胞转染48 h 和72 h 后收集病毒粗液，感染 HepG2．2．15细胞。感染72 h 后用荧光显微镜观察并评估荧光细胞比例。结果针对16个乙酰化酶基因，构建128个慢病毒载体 RNA 干扰（RNAi）文库，72 h 后慢病毒感染 HepG2．2．15细胞的效率＞80％。结论成功构建16个组蛋白乙酰化酶的 shRNA 慢病毒载体，从而为研究人组蛋白乙酰化酶对 HBV 复制的影响奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 病毒复制 组蛋白酰基转移酶 短发夹 RNA RNA 干扰
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载短发夹RNA质粒的阳离子高分子脂质体载体的制备及理化性质的研究
8
作者 刘刚 卫江鹏 +2 位作者 王建林 赵承梅 常津 《中华生物医学工程杂志》 CAS 2015年第6期495-499,共5页
目的 探索载短发夹RNA（shRNA）质粒的阳离子高分子脂质体（CPL）的制备方法及其理化性质,确定二者耦合的最佳结合比,优化转染方案.方法 构建CPL,并对其进行表征,通过噻唑兰比色法检测CPL对细胞增殖的影响.将CPL与载shRNA质粒耦合,分为... 目的 探索载短发夹RNA（shRNA）质粒的阳离子高分子脂质体（CPL）的制备方法及其理化性质,确定二者耦合的最佳结合比,优化转染方案.方法 构建CPL,并对其进行表征,通过噻唑兰比色法检测CPL对细胞增殖的影响.将CPL与载shRNA质粒耦合,分为空白对照组（不做任何干预）、Lipofectamine2000转染组及不同质量比（1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3）的质粒与CPL耦合成pCPL-shRNA组,转染人结肠癌细胞系HCT-116细胞,采用流式细胞仪检测载shRNA质粒的CPL的转染效率.结果 所构建的CPL为近球形、大小较一致、表面较光滑、分散性较好的纳米粒子,平均粒径为（95.58±4.21） nm.随CPL浓度增加,细胞抑制率逐渐升高,两者呈线性相关（R2=0.9851,P＜0.05）,IC50=7.605＆#215; 10-2 g/L.载shRNA质粒与CPL在最佳结合比为1∶2,转染效率为（28.19±5.38）％,优于转染剂Lipofetamine组（21.33±6.11）％（P＜0.05）.结论 构建的载shRNA质粒的CPL是一种较为理想的基因转运载体. 展开更多
关键词 阳离子高分子脂质体 短发夹 质粒 RNA干扰 载体 理化性质
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干扰RNA沉默HIF-1α在缺氧状态下对骨肉瘤细胞VEGF表达的影响 被引量：24
9
作者 吴强 杨述华 +3 位作者 王锐英 叶树楠 夏天 马德彰 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第5期531-535,共5页
背景与目的:研究表明H IF-1α是肿瘤适应低氧微环境、诱导血管新生的一个主要调控因子。本研究通过观察体外低氧培养条件下骨肉瘤细胞系SaOS-2中H IF-1α和VEGF的表达,探讨H IF-1α在骨肉瘤缺氧激活血管新生调控途径中的作用。方法:CoCl... 背景与目的:研究表明H IF-1α是肿瘤适应低氧微环境、诱导血管新生的一个主要调控因子。本研究通过观察体外低氧培养条件下骨肉瘤细胞系SaOS-2中H IF-1α和VEGF的表达,探讨H IF-1α在骨肉瘤缺氧激活血管新生调控途径中的作用。方法:CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境。半定量RT-PCR和免疫组化法分别检测不同缺氧时相中H IF-1α和VEGF在m RNA和蛋白水平的表达。构建针对H IF-1α的短发夹状小干扰RNA真核表达载体并转染SaOS-2细胞。免疫印迹沉淀观察转染后H IF-1α的基因沉默效果,RT-PCR和ELISA双抗体夹心法检测H IF-1α短基因沉默后SaOS-2细胞中VEGF的变化。结果:低氧条件下,SaOS-2细胞H IF-1αm RNA水平稳定,蛋白表达显著升高;而VEGF m RNA和蛋白的表达均显著升高。构建的H IF-1α短发夹状小干扰RNA表达载体转染SaOS-2细胞后能够显著下调H IF-1α基因的表达,同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论:缺氧促使SaOS-2细胞H IF-1α在蛋白水平表达升高,H IF-1α通过转录激活VEGF的机制促进骨肉瘤缺氧状态下的血管新生。 展开更多
关键词 骨肉瘤 缺氧诱导因子-1Α 血管内皮生长因子 短发夹状小干扰RNA
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短发夹RNA介导RNA干扰的时间和剂量效应研究 被引量：13
10
作者 何国平 张思仲 +7 位作者 王英成 肖翠英 马用信 许文明 丁兰 陶大昌 孙岩 陈玉娟 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第3期258-267,共10页
用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达,以探讨该过程中RNAi作用的剂量和时间效应.应用Lipofectamine 2000将外源报告基因的表达载体与编码短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)的质粒共转染HEK293H细... 用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达,以探讨该过程中RNAi作用的剂量和时间效应.应用Lipofectamine 2000将外源报告基因的表达载体与编码短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)的质粒共转染HEK293H细胞,观察shRNA载体对报告基因的抑制效应.转染后,shRNAs的瞬时表达可特异地抑制细胞内报告基因的表达.在共转染后12,24,48,60,72,96 h时检测EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因mRNA及蛋白质表达水平,结果显示,EGFPmRNA及蛋白质表达在12 h时略有降低,24～48 h时表达逐渐降低,48～72 h时降低最明显,其后EGFP表达水平逐渐恢复.提示该过程中RNAi效应呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势.共转染一系列剂量比例的EGFP干扰载体与靶载体的结果表明,在一定剂量范围内,RNA干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关,当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时,抑制效应则维持在一'平台期'.此外,通过RNAi抑制HeLa细胞、HEK293细胞中荧光素酶基因的表达,荧光素酶活性变化也表现出上述类似的效应.这些结果表明,在体外哺乳动物细胞中,基于表达载体的RNAi作用呈现剂量和时间依赖性效应.这为基于载体表达的RNAi技术应用研究提供了一定的理论参考及依据. 展开更多
关键词 RNA干扰 短发夹RNA 报告基因 共转染 时间和剂量效应
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短发夹状RNA抑制survivin基因在肝癌细胞中的表达 被引量：14
11
作者 闫歌 黄爱龙 +5 位作者 唐霓 张秉强 蒲丹 向明确 兰英华 吴刚 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 2003年第12期712-715,共4页
目的 构建抗凋亡因子survivin的短发夹状RNA(shRNA),观察其在肝癌细胞株HepG2、SMMC—7721中对survivin基因表达的抑制作用。方法 设计、合成两对survivin编码基因的反向重复序列,中间分别间隔4和8个nt,分别定向克隆至载体pTZU6+1的U6... 目的 构建抗凋亡因子survivin的短发夹状RNA(shRNA),观察其在肝癌细胞株HepG2、SMMC—7721中对survivin基因表达的抑制作用。方法 设计、合成两对survivin编码基因的反向重复序列,中间分别间隔4和8个nt,分别定向克隆至载体pTZU6+1的U6转录启动子下,构建pshRNA—survivin 1和pshRNA—survivin 2重组质粒,与表达survivin基因的质粒pEGFP—C1-survivin共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC—7721,荧光显微镜下观察融合蛋白中GFP的表达以分析pshRNA—survivin对survivin基因表达的抑制作用。结果 酶切分析和测序证实pshRNA—survivin 1和pshRNA—survivin 2构建成功;两组shRNA对survivin的表达均有明显的抑制作用,抑制率达80％以上;两重组质粒在HepG2和SMMC—7721两种细胞中抑制目的基因的作用无明显差异;反向重复序列中间隔4或8个nt构建的shRNA,对抑制目的基因的表达无显著差异。结论 构建的pshRNA—survivin重组质粒能有效抑制survivin基因在肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721中的表达。 展开更多
关键词 短发夹状RNA SURVIVIN基因 肝癌 癌细胞 细胞凋亡 基因治疗
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短发夹RNA沉默hTERT基因对人喉癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用 被引量：12
12
作者 刘丹 陶泽璋 +2 位作者 肖伯奎 陈始明 池花明 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第1期11-16,共6页
背景与目的:RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指双链RNA导入细胞后诱导靶mRNA发生特异性的降解,导致基因转录后沉默的现象。RNAi在基因功能和抗病毒基因治疗等方面均有报道。但对喉癌等头颈恶性肿瘤中高表达的人端粒酶逆转录酶(humantel... 背景与目的:RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指双链RNA导入细胞后诱导靶mRNA发生特异性的降解,导致基因转录后沉默的现象。RNAi在基因功能和抗病毒基因治疗等方面均有报道。但对喉癌等头颈恶性肿瘤中高表达的人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)基因,目前尚未见报道。本课题利用RNAi技术,研究短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)抑制hTERT基因表达对裸鼠喉鳞状细胞癌皮下移植模型的抑瘤作用。方法:根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA。建立人喉癌Hep-2细胞株裸鼠皮下接种模型。将pshRNA转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况。以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤组织内的表达;以HE染色法观察质粒治疗后瘤组织的病理改变;以原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况;以免疫组化SP法检测hTERT蛋白在肿瘤内的表达;光镜下观察心、肝、肾、脾结构的改变并测量血液学和血液生化指标。结果:pshRNA组(A组)、空质粒载体组(B组)与生理盐水组(C组)之间比较,A组与C组瘤体积有显著性差异(P<0.01),B组与C组之间瘤体积无显著性差异(P>0.05),抑瘤率为76.50%。pshRNA及空质粒载体转染入瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光。病理学检查及TUNEL检测发现:A组肿瘤生长受到抑制,细胞分裂相少见,可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡,该组肿瘤细胞的凋亡指数[(26.47±4.25)%]明显高于B组[(3.40±1.41)%]和C组[(2.73±1.35)%]。给予pshRNA后瘤体内hTERT蛋白表达明显下调,而且对心、肝、肾、脾无明显损害,对造血系统无影响。结论:表达shRNA的DNA载体质粒沉默hTERT基因可显著抑制人喉癌裸鼠肿瘤的生长,而且对心、肝、肾、脾及造血系统无明显的毒副作用。 展开更多
关键词 喉肿瘤 短发夹RNA HTERT 癌 鳞状细胞
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Ki67基因短发夹状RNA表达载体对肾癌细胞生长的抑制作用 被引量：15
13
作者 郑骏年 陈家存 +8 位作者 孙晓青 郑典宝 曹敬毅 温儒民 王军起 刘俊杰 史启铎 韩瑞发 马腾骧 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期744-746,共3页
目的研究针对Ki67基因的短发夹状RNA(shRNA)表达载体pSilencer-Ki67对人肾癌细胞生长的抑制作用。方法将pSilencer-Ki67转染人肾癌786-0细胞,24、48、72、120、144 h后分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Ki67 m... 目的研究针对Ki67基因的短发夹状RNA(shRNA)表达载体pSilencer-Ki67对人肾癌细胞生长的抑制作用。方法将pSilencer-Ki67转染人肾癌786-0细胞,24、48、72、120、144 h后分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Ki67 mRNA、蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,原位末端标记法检测细胞凋亡。结果pSilencer-Ki67转染后48 h 786-0细胞Ki67mRNA表达(34．1±1．7)%、蛋白表达(42．6±1．7)%降低最明显,与空质粒对照组[(97．7±0．9)%、(97．3±1．6)%]比较差异均有统计学意义(P＜0．01)。pSilencer-Ki67处理后48 h细胞增殖抑制率(76．7±3．2)%最高,72 h凋亡细胞阳性率(74．3±5．9)%最高,与空质粒对照组[(7．0±0．5)%、(8．4±1．1)%]比较差异有统计学意义(P＜0．01)。pSilencer-Ki67的这些作用可持续144 h。结论pSilencer-Ki67能有效、持续抑制人肾癌786-0细胞生长,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。 展开更多
关键词 肾癌 短发夹状RNA 质粒 基因治疗
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RNA干扰真核表达载体pEGFP-H1介导的血管内皮生长因子shRNA治疗人胶质瘤的实验研究 被引量：10
14
作者 姜晓兵 赵洪洋 +3 位作者 周凤 刘如恩 张方成 赵甲山 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期547-550,共4页
目的　构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(pEGFPH1 /VEGF),观察其在体内和体外对胶质瘤细胞株U251生长的抑制作用。方法　应用PCR构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP- H1,并利用该载体介... 目的　构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(pEGFPH1 /VEGF),观察其在体内和体外对胶质瘤细胞株U251生长的抑制作用。方法　应用PCR构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP- H1,并利用该载体介导VEGFshRNA。用阳离子脂质体转染U251细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP的表达,用RT- PCR检测VEGFmRNA的表达,以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养液中VEGF蛋白的含量。同时筛选转染pEGFP- H1和pEGFP- H1 /VEGF的U251稳定细胞株,制备裸鼠U251细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况。结果　与空载体转染组相比, pEGFP- H1 /VEGF对VEGF的抑制率达77. 9%。对照组和pEGFP -H1组裸鼠肿瘤重量分别为1 .7g±0 4g和1 .5g±0 .7g,体积分别为1573mm3 ±330mm3 和1430mm3 ±382mm3,两组之间重量和体积差异均无统计学意义(P>0 .05 ),而pEGFP- H1 /VEGF组肿瘤重量为0 .5g±0 .4g,体积为401mm3 ±272mm3,与对照组比较差异有统计学意义(P<0. 01)。结论　pEGFP H1介导的VEGFshRNA能有效抑制U251细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长。 展开更多
关键词 VEGF EGFP 血管内皮生长因子 肿瘤 介导 治疗 真核表达载体 U251细胞 RNA干扰 短发夹环RNA
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Survivin shRNA增强人卵巢癌耐药细胞OVCAR3对泰素敏感性的研究 被引量：11
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作者 颜笑健 梁立治 +2 位作者 曾宗渊 石智 符立梧 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第4期398-403,共6页
背景与目的:耐药是目前恶性肿瘤治疗急需解决的难题。最近研究显示,卵巢癌组织及细胞中均有Survivin高表达,可能与其抑癌耐药有关。本研究探讨Survivin的短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)对人卵巢癌耐药细胞OVCAR3Survivin基因表达... 背景与目的:耐药是目前恶性肿瘤治疗急需解决的难题。最近研究显示,卵巢癌组织及细胞中均有Survivin高表达,可能与其抑癌耐药有关。本研究探讨Survivin的短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)对人卵巢癌耐药细胞OVCAR3Survivin基因表达、凋亡及其对泰素、顺铂敏感性的影响。方法:脂质体介导SurvivinshRNA转染OVCAR3。转染空载体或脂质体的细胞及未转染细胞作为对照。逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测SurvivinmRNA的表达,流式细胞仪分析Survivin蛋白的表达及细胞凋亡率。四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)测定SurvivinshRNA转染后OVCAR3细胞对泰素的敏感性。结果:与未转染组、空脂质体组、空载体组相比较,SurvivinshRNA处理24h后细胞SurvivinmRNA及蛋白表达水平均明显下调。SurvivinshRNA转染12、24、36、48h后的细胞凋亡率分别为20.7%、31.9%、39.0%、46.7%,呈时间依赖性。MTT结果显示,泰素对未转染组、空脂质体组、空载体组、转染组OVCAR3细胞的IC50分别为(0.305±0.032)μmol/L、(0.157±0.031)μmol/L、(0.175±0.010)μmol/L、(0.019±0.001)μmol/L;顺铂对4组OVCAR3细胞的IC50依次为(9.410±0.796)μmol/L、(6.675±1.739)μmol/L、(6.930±1.273)μmol/L、(7.862±0.081)μmol/L,SurvivinshRNA使OVCAR3对泰素的敏感性提高16倍(P<0.01),但是对顺铂的影响不大(P>0.05)。结论:靶向Survivin的序列特异性shRNA可有效抑制OVCAR3细胞中Survivin基因的表达,同时可以增强OVCAR3对泰素的敏感性,但不增加其对顺铂的敏感性。 展开更多
关键词 卵巢肿瘤 耐药细胞OVCAR3 SURVIVIN RNA干扰 短发夹RNA 凋亡 泰素 抑瘤作用
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bcl-x_L短发夹状RNA诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡(英文) 被引量：8
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作者 何承伟 刘芳 +2 位作者 张月飞 梁统 周克元 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第6期646-652,共7页
背景与目的:实验证明bcl-xL 在鼻咽癌细胞株CNE-2Z 中存在高表达,它可能在鼻咽癌的发生发展、转移及治疗过程中产生耐药等方面发挥重要作用。本研究拟探讨bcl-xL 短发夹状RNA (shorthairpin RNA ,shRNA )诱导CNE-2Z 细胞凋亡的作用。方... 背景与目的:实验证明bcl-xL 在鼻咽癌细胞株CNE-2Z 中存在高表达,它可能在鼻咽癌的发生发展、转移及治疗过程中产生耐药等方面发挥重要作用。本研究拟探讨bcl-xL 短发夹状RNA (shorthairpin RNA ,shRNA )诱导CNE-2Z 细胞凋亡的作用。方法:把表达bcl-xL shRNA 的重组质粒pm U6-RNAi转染到CNE-2Z细胞中,用荧光染色和流式细胞术等方法检测细胞凋亡;用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polym erase chain reaction,RT-PCR )检测bcl-xL、bcl-2、survivin和caspase-3的m RNA 表达水平;用W estern blot检测Bcl-xL、Caspase-3和P53的蛋白表达水平。结果:流式细胞术检测发现,pm U6-RNAi重组质粒作用24h 后,细胞出现明显的凋亡峰;H oechst33258单染在荧光显微镜下可见细胞缩小、染色质固缩和核断裂;RT-PCR 分析pm U6-RNAi重组质粒作用细胞后明显下调了bcl-xL、bcl-2和caspase-3的m RNA 表达水平, 对survivin 的m RNA 表达水平无影响;W estern blot分析pm U6-RNAi质粒作用细胞后明显下调了Bcl-xL、Caspase-3的蛋白表达水平,而大幅度上调了P53的蛋白表达水平。结论:bcl-xL shRNA 可诱导CNE-2Z 细胞凋亡;CNE-2Z 细胞的凋亡可能与bcl-2、caspase-3和p53有着密切的关系;质粒表达的bcl-xL shRNA 展开更多
关键词 鼻咽肿瘤 短发夹状RNA BCL-XL 细胞凋亡
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短发夹状RNA在人细胞诱导RNA干扰(英文) 被引量：7
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作者 陈扬超 宋超 罗超权 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第6期566-570,共5页
背景与目的:RNA干扰是一种通过细胞内导入双链RNA而导致特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前RNA干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状RNA(shorthairpinRNAs,shRNA),通过这些s... 背景与目的:RNA干扰是一种通过细胞内导入双链RNA而导致特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前RNA干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状RNA(shorthairpinRNAs,shRNA),通过这些shRNA来诱导RNA干扰(RNAinterference,RNAi),为基因功能分析提供新的实验手段。方法:利用双荧光素酶报告系统来检测DNA载体在细胞内产生的shRNA诱导RNAi的效果。比较该载体产生的shRNA在不同条件下的RNA干扰效果。结果:DNA载体产生的shRNA在人细胞能诱导RNAi,序列特异地抑制基因表达。抑制效果与所选基因靶位点高度相关。结论:shRNA在人细胞能诱导RNA干扰,序列特异地抑制基因表达,这一方法可用于基因功能分析。 展开更多
关键词 短发夹状RNA RNA干扰 DNA载体 双荧光素酶报告系统 基因表达 细胞生物学
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沉默JAG1基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响 被引量：11
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作者 袁磊 李伯和 +3 位作者 时冉冉 高丽 宋金玲 王建国 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期262-267,共6页
目的:探究沉默Jagged 1(JAG1)基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响及其分子生物学机制。方法:用已构建的pRS-JAG1重组质粒转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,采用Western blotting方法检测重组质粒对JAG1蛋白表达的影响;MTT比色法... 目的:探究沉默Jagged 1(JAG1)基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响及其分子生物学机制。方法:用已构建的pRS-JAG1重组质粒转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,采用Western blotting方法检测重组质粒对JAG1蛋白表达的影响;MTT比色法测定沉默JAG1对细胞生长的抑制情况;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;蛋白印记分析细胞周期蛋白1(cyclin D1)、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p-Rb、Bcl-2、Bax、Bcl-xL和cleaved caspase-3蛋白水平的变化。结果:Western blotting结果证实重组质粒可在72h内有效抑制JAG1蛋白表达;人乳腺癌MDA-MB-231细胞JAG1被沉默后,细胞的生长速度明显减慢,细胞明显阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),cyclin D1、p-Rb、Bcl-2和Bcl-xL蛋白水平被下调(P<0.05),而p21CIP1/WAF1、p27KIP1、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论:沉默JAG1可有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡。本研究为以JAG1为分子靶点的三阴乳腺癌治疗提供实验依据。 展开更多
关键词 JAG1蛋白 短发夹RNA 细胞周期 细胞凋亡 MDA—MB-231细胞
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联合基因Survivin、CDK1的shRNAs靶向干扰对鼻咽癌CNE-2细胞增值的影响 被引量：11
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作者 陈淑萍 周红桃 +3 位作者 蔡俊宏 王福利 许茂轩 符生苗 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期239-247,共9页
为了构建具有干扰效应的靶向Survivin和CDK1基因及两者串联的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体,并研究其靶向干扰对鼻咽癌细胞CNE-2生物学行为的改变。本研究通过构建pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA... 为了构建具有干扰效应的靶向Survivin和CDK1基因及两者串联的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体,并研究其靶向干扰对鼻咽癌细胞CNE-2生物学行为的改变。本研究通过构建pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA重组载体,用脂质体Lipofectamine 2000法将其转染入CNE-2细胞株中,应用RT-PCR方法初步筛选具有干扰效应的重组载体,逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Survivin、CDK1 mRNA的基因表达水平,Western blot检测Survivin和CDK1蛋白表达以及噻唑蓝溴化四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测癌细胞增殖活性的变化。结果表明:成功构建具有干扰效应的shRNAs表达载体;联合或单基因Survivin、CDK1的shRNAs表达载体干扰CNE-2细胞后,其对应的mRNA和目的蛋白表达均降低,CNE-2癌细胞增殖活性降低,联合基因shRNAs表达载体具有一定程度的干扰增强作用。 展开更多
关键词 短发夹样RNA Survivin基因 CDK1基因 鼻咽癌 CNE-2
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磷脂酰肌醇蛋白聚糖3转录干预对肝癌细胞侵袭和血管新生的抑制作用 被引量：10
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作者 蔚丹丹 姚敏 +7 位作者 陈洁 王理 严美娟 顾星 邱历伟 董志珍 姚登福 陆少林 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期452-458,共7页
目的探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC-3）特异性短发夹RNA（shRNA）对肝癌细胞侵袭和血管新生的抑制作用与机制。方法将GPC-3特异性shRNA转染肝癌细胞，检测GPC-3mRNA及蛋白表达的变化；分析其对细胞增殖、凋亡及细胞侵袭能力的影响。样... 目的探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC-3）特异性短发夹RNA（shRNA）对肝癌细胞侵袭和血管新生的抑制作用与机制。方法将GPC-3特异性shRNA转染肝癌细胞，检测GPC-3mRNA及蛋白表达的变化；分析其对细胞增殖、凋亡及细胞侵袭能力的影响。样本均数两两比较采用独立样本f检验，多样本均数比较采用单因素方差分析。结果shRNA转染肝癌细胞的效率大于80％，GPC-3shRNA1转染HepG2、MHCC-97H和Huh7肝癌细胞后，GPC-3mRNA水平分别为2．13±1．10、4．94±0．59、3．66±0．32，与空白对照组的19．34±0．90、20．24±1．61、β．97±1．15相比，f值分别为21．786、15．473、15．004，P值均〈0．001，差异均有统计学意义，且GPC-3shRNAl可明显诱导细胞凋亡，抑制肝癌细胞增殖、运动及侵袭能力。HepG2、MHCC-97H和Huh7肝癌细胞干扰组p-连环蛋白mRNA表达分别为6．82±0．21、4．01±0．52和5．47±O．90，与阴性对照组的12．52±0．30、12．03±0．98、12．45±0．26比较，f值分别为26．903、12．578和12．870，P值均〈0．001，差异均有统计学意义；GlilmRNA水平分别为9．78±1．35、10．78±1．15和10．93±0．97，与阴性对照组的6．49±0．72、6．80±0．79、10．03±0．97比较，f值分别为-3．730±4．918和-3．083，P值均〈0．05，差异均有统计学意义。GPC-3shRNA1还可下调HepG2和MHCC-97H细胞胰岛素样生长因子Ⅱ和血管内皮生长因子表达。结论GPC-3shRNA1可下调GPC-3mRNA水平，通过wnt／β-连环蛋白和Hedgehogs信号通路抑制癌细胞迁移、侵袭和血管新生，提示GPC-3为肝癌基因治疗潜在的分子靶目标。 展开更多
关键词 癌 肝细胞 信号传导 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 短发夹RNA 血管新生
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