农杆菌注射渗透法转化烟草实验研究 被引量：16

1

作者 黎茵 张以顺 《实验技术与管理》 CAS 北大核心 2010年第11期50-52,共3页

利用携带植物表达载体质粒pCambia2301的农杆菌菌株,通过注射渗透法对烟草叶片进行感染转化,组织化学染色检测GUS报告基因瞬时表达的结果表明,在O.D.600值为0.4~0.8范围内的菌液浓度不影响转化效果,感染时间72 h以上可使瞬时表达的阳性... 利用携带植物表达载体质粒pCambia2301的农杆菌菌株,通过注射渗透法对烟草叶片进行感染转化,组织化学染色检测GUS报告基因瞬时表达的结果表明,在O.D.600值为0.4~0.8范围内的菌液浓度不影响转化效果,感染时间72 h以上可使瞬时表达的阳性检出率达到100%,农杆菌菌株EHA105比LBA4404表现出更强的转化活性。 展开更多

关键词 烟草 瞬时转化 根癌农杆菌 渗透法

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一种植物原生质体分离与瞬时转化的方法 被引量：10

2

作者 赖叶林 贺莹 +1 位作者 李欣欣 廖红 《植物生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期895-903,共9页

本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)、本氏烟草(Nicontiana benthamiana)和大豆(Glycine max)为试验材料,通过酶解法结合去除叶片下表皮的预处理,以及PEG介导的转化,建立了一种操作简单且高效的原生质体分离和瞬时转化方法,为目标基... 本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)、本氏烟草(Nicontiana benthamiana)和大豆(Glycine max)为试验材料,通过酶解法结合去除叶片下表皮的预处理,以及PEG介导的转化,建立了一种操作简单且高效的原生质体分离和瞬时转化方法,为目标基因的亚细胞定位分析和基于原生质体为受体材料进行遗传等方面的基础研究提供方法支撑。结果表明,利用上述方法, 3种植物均能获得较高产量且低破损率的原生质体,同时避免了原生质体的纯化过程。其中,拟南芥的原生质体产量最高,其次是大豆和烟草;并且,烟草和拟南芥原生质体转化效率较高,大豆较低,烟草和拟南芥原生质体的转化效率高达50%以上,分别是大豆的3.84和3.62倍。进一步的亚细胞定位分析发现,烟草和拟南芥的原生质体在GFP和RFP共转定位时存在优势,可用于目标基因的亚细胞定位分析。 展开更多

关键词 原生质体 分离 瞬时转化 亚细胞定位

原文传递

苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化 被引量：10

3

作者 张钟仁 陈鹏 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期183-189,共7页

高效分离原生质体是遗传转化、细胞融合和再生培养的基础性工作。该实验以苦荞（Fagopyrum tartaricum）品种‘榆6-21’的叶肉细胞为材料,研究了酶类组合、甘露醇浓度、酶解时间以及离心速度对苦荞叶肉细胞原生质体分离纯化的影响。结... 高效分离原生质体是遗传转化、细胞融合和再生培养的基础性工作。该实验以苦荞（Fagopyrum tartaricum）品种‘榆6-21’的叶肉细胞为材料,研究了酶类组合、甘露醇浓度、酶解时间以及离心速度对苦荞叶肉细胞原生质体分离纯化的影响。结果表明：酶解液组成为1.5%纤维素酶R-10＋0.5%离析酶R-10＋0.5mol/L甘露醇＋20mmol/L MES＋20mmol/L KCl＋10mmol/L CaCl2＋0.1%牛血清白蛋白,以第5~7片真叶为材料,用胶带纸撕去叶片下表皮后,25℃黑暗酶解4h,以900r/min离心收集,可以获得高质量的原生质体,原生质体产量可达6×106个/g,活力达到90%以上;用双荧光素酶报告基因载体检测原生质体的转化效率,以分离纯化的苦荞叶肉细胞原生质体为受体,将双荧光素酶报告基因载体与其混合后,在终浓度为20%PEG4000介导下,黑暗转化20min,可以检测到较高活性的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶,证明双荧光素酶报告载体可成功转化到原生质体中。研究结果为苦荞原生质体瞬时转化及遗传操作提供了技术基础。 展开更多

关键词 苦荞 原生质体 分离和纯化 瞬时转化 双荧光素酶报告载体

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棉花CRISPR/Cas9基因编辑有效sgRNA高效筛选体系的研究 被引量：9

4

作者 周冠彤 雷建峰 +3 位作者 代培红 刘超 李月 刘晓东 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期427-437,共11页

单向导RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系的重要元件之一。然而研究显示,很多sgRNA不能有效工作,因此需要对多个设计的候选sgRNA进行筛选,以验证它们的有效性。早期对sgRNA有效性的验证采用的是完整编辑载体瞬时转化原生质体... 单向导RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系的重要元件之一。然而研究显示,很多sgRNA不能有效工作,因此需要对多个设计的候选sgRNA进行筛选,以验证它们的有效性。早期对sgRNA有效性的验证采用的是完整编辑载体瞬时转化原生质体或者叶片的方法。这些方法费时费力,成功率不高,尤其是对于原生质体制备效率比较低的棉花。本研究针对GhMAPKKK2和GhAE基因分别设计靶序列,构建了只转录sgRNA的载体:GhU6-5P::MAPKKK2-sgRNA-1300和GhU6-5P::AE-sgRNA-1300,并通过农杆菌注射YZ-1 Cas9转基因棉花植株叶片;与此同时,构建了对应完整的CRISPR/Cas9基因组编辑载体:GhU6-5P::MAPKKK2-sgRNA-Cas9和GhU6-5P::AE-sgRNA-Cas9,并通过农杆菌注射YZ-1野生型棉花植株的叶片。另外,针对GhPDS、GhCLA1、GhMAPKKK2和GhAE基因分别设计靶序列并构建了GhU6-5P-2::PDS-sgRNA-CLCrVA、GhU6-5P-2::CLA1-sgRNA-CLCrVA、GhU6-5P-2::MAPKKK2-sgRNA-CLCrVA和GhU6-5P-2::AE-sgRNA-CLCrVA病毒投送载体,通过农杆菌注射YZ-1 Cas9转基因棉花植株叶片。以上试验均以转化对应空载体的植株为对照。对转化后的棉花叶片基因组DNA进行PCR扩增后酶切,并对未完全消化的PCR产物进行克隆测序,结果显示,转化GhU6-5P::AE-sgRNA-1300、GhU6-5P::MAPKKK2-sgRNA-Cas9、GhU6-5P::AE-sgRNA-Cas9载体的棉花植株均未检测到靶基因突变,而转化GhU6-5P::MAPKKK2-sgRNA-1300、GhU6-5P-2::PDS-sgRNA-CLCrVA、GhU6-5P-2::CLA1-sgRNA-CLCrVA、GhU6-5P-2::MAPKKK2-sgRNA-CLCrVA和GhU6-5P-2::AE-sgRNA-CLCrVA载体的Cas9转基因阳性植株基因序列发生了改变,突变类型包括碱基替换、碱基缺失和碱基插入。表明以Cas9转基因阳性植株为转化受体的策略可以高效真实地验证sgRNA的有效性,排除了因转化效率低而带来的假阴性的结果,且病毒载体投送sgRNA的策略更高效、更准确。该sgRNA高效验证体系的建立,为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。 展开更多

关键词 棉花 瞬时转化 CRISPR/Cas9 基因组编辑

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甘蓝原生质体制备体系优化及瞬时转化体系的建立 被引量：8

5

作者 王飞 钟雄辉 +3 位作者 陈登辉 李海龙 康俊根 颉建明 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2020年第3期69-78,共10页

为研究甘露醇浓度、酶解时间、离心力大小和不同外植体对原生质体产量和活力的影响,采用正交试验方案对甘蓝原生质体制备体系进行了优化,并建立了甘蓝原生质体的瞬时转化体系,同时利用该体系对甘蓝CRISPR/Cas9基因编辑系统进行了初步研... 为研究甘露醇浓度、酶解时间、离心力大小和不同外植体对原生质体产量和活力的影响,采用正交试验方案对甘蓝原生质体制备体系进行了优化,并建立了甘蓝原生质体的瞬时转化体系,同时利用该体系对甘蓝CRISPR/Cas9基因编辑系统进行了初步研究。结果表明:以下胚轴为材料,酶液组成为1%纤维素酶+0.5%离析酶+0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl2+0.1%BSA+5 mmol/Lβ-巯基乙醇,26℃,60 r/min,黑暗酶解6 h后,用2 115 r/min离心5 min收集细胞,可获得高质量的原生质体,原生质体产量约为3.0×106个/g,活力约为90.9%;另外,在20%PEG4000介导下,将带有绿色荧光蛋白的载体(PYBA 1132)分别转入从甘蓝下胚轴、子叶、叶球分离获得的原生质体中,在荧光显微镜下观察到GFP绿色荧光信号,转化效率分别为43%,35%,19%,表明下胚轴分离获得的原生质体最适于瞬时转化。同时以下胚轴分离获得的原生质体为受体,分别转化线粒体特异表达载体COX和质体特异表达载体969,也观察到了荧光信号,成功建立了甘蓝原生质体瞬时转化体系,为甘蓝功能基因定位与功能分析提供了技术平台。最后,利用该体系对CRISPR/Cas9基因编辑载体(PBSE401-BoPDS)中sgRNA的靶向编辑能力进行了检测,结果显示,靶点1和靶点2附近的序列中有碱基替换和插入,表明该体系能够应用于甘蓝瞬时基因编辑,为甘蓝基因功能研究以及新种质的创制建立了重要的技术平台。 展开更多

关键词 甘蓝 原生质体 瞬时转化 正交设计 CRISPR/Cas9

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柽柳再生和转化体系的建立及瞬时转化TcSYP121基因功能分析

6

作者 韩帅 靳芊芊 +2 位作者 殷楠 张国君 徐兴兴 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期823-833,共11页

【目的】建立柽柳再生及遗传转化体系并分析瞬时转化柳树突触融合蛋白(TcSYP121)基因功能,为筛选柽柳分子抗性育种候选基因及盐碱土的改良和生态修复提供理论参考。【方法】通过单因素筛选最佳外植体、消毒处理、各阶段(初代、分化、增... 【目的】建立柽柳再生及遗传转化体系并分析瞬时转化柳树突触融合蛋白(TcSYP121)基因功能,为筛选柽柳分子抗性育种候选基因及盐碱土的改良和生态修复提供理论参考。【方法】通过单因素筛选最佳外植体、消毒处理、各阶段(初代、分化、增殖和生根)的培养基类型及激素浓度建立柽柳再生体系;通过正交试验分析影响转化体系的4个因素(预培养时间、侵染时间、共培养时间和农杆菌浓度);通过PCR扩增及电泳结果验证柽柳转化体系;瞬时转化TcSYP121基因获得过表达植株(OE)和病毒诱导的基因沉默植株(VI),进行表型观测、植物超氧阴离子染色液(NBT)和二氨基联苯胺法(DAB)染色并测定盐腺直径和盐腺密度、叶绿素含量、超氧化物酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性及TcSYP121基因相对表达量,分析TcSYP121基因的功能。【结果】最优外植体为柽柳嫩茎段,最适宜次氯酸钠(NaClO)消毒浓度为5%,最佳消毒时间为5 min,最适合的初代培养基为MS培养基,最佳分化培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,最佳增殖培养基为MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA,最佳生根培养基是1/2MS+0.5mg/L IBA。转化体系中正交试验结果为最佳预培养时间是2 d,最佳侵染时间是5 min,最佳共培养时间是2 d,最佳农杆菌浓度OD600为0.8,抗生素头孢霉素(Cef)浓度为300 mg/L,卡那霉素(Kan)筛选压为30 mg/L。PCR扩增及电泳结果显示,利用该遗传转化体系可获得阳性转基因植株。瞬时转化TcSYP121基因柽柳的耐盐功能分析结果显示,在盐胁迫下,VI和对照(CK)柽柳中叶绿素含量显著下降(P<0.05),而OE下降不显著(P>0.05);OE柽柳SOD和POD活性均高于VI与CK,且OE中Tc SYP121基因的相对表达量高于CK和VI。【结论】建立了柽柳的再生体系和遗传转化体系,通过对柽柳进行瞬时转化获得过表达和沉默表达柽柳,证实TcSYP121基因能够提高柽柳耐盐性。 展开更多

关键词 柽柳 转化体系 再生体系 TcSYP121基因 瞬时转化 耐盐

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‘红满堂’苹果MbbZIP43基因的克隆与功能研究

7

作者 杨艳 胡洋 +7 位作者 刘霓如 殷璐 杨锐 王鹏飞 穆霄鹏 张帅 程春振 张建成 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期146-159,共14页

【目的】为探究碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子在‘红满堂’苹果花青素代谢中的调控作用。【方法】从‘红满堂’苹果克隆得到一个bZIP基因,分析了其基因及编码蛋白序列特性,利用洋葱表皮细胞瞬时转化确定其编码蛋白亚细胞定位,利用实时... 【目的】为探究碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子在‘红满堂’苹果花青素代谢中的调控作用。【方法】从‘红满堂’苹果克隆得到一个bZIP基因,分析了其基因及编码蛋白序列特性,利用洋葱表皮细胞瞬时转化确定其编码蛋白亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)研究了该基因在不同成熟时期‘红满堂’果实中的表达情况,基于烟草叶片、苹果叶片以及苹果果实瞬时转化研究了其对花青素积累和花青素合成相关结构基因表达的调控作用。【结果】该基因不含内含子,与MdbZIP43(XP_008393381.1)相似度最高,故命名为MbbZIP43。其编码序列长为522 bp,可编码由173 aa组成、含有bZIP_plant_GBF1结构域、定位于细胞核的亲水蛋白。RT-qPCR分析结果显示,随着果实成熟,MbbZIP43在‘红满堂’果实中的表达水平呈“先升后降”的变化趋势,在花后11周的果实中表达量最高。相关性分析显示MbbZIP43基因表达量与总黄酮和花青素含量正相关。瞬时过表达该基因的烟草叶片、苹果叶片和果皮中花青素含量分别提高了17.42%、25.66%和48.99%,过表达MbbZIP43的苹果叶片中花青素合成结构基因CHI、F3'H、DFR和UFGT分别提高了2.27倍、1.84倍、2.39倍和2.89倍;过表达MbbZIP43的苹果果皮中CHI、F3'H、DFR和UFGT分别提高了1.79倍、1.70倍、1.35倍和1.51倍,说明MbbZIP43可以通过上调这些结构基因的表达正调控苹果花青素合成。【结论】MbbZIP43可通过激活花青素合成相关结构基因CHI和UFGT等的表达进而促进花青素的积累。 展开更多

关键词 bZIP转录因子 苹果 花青素合成调控 基因克隆 瞬时转化 表达分析 亚细胞定位

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植物原生质体分离及其瞬时转化的应用

8

作者 马超越 彭世清 +2 位作者 郭冬 朱家红 王颖 《热带生物学报》 2024年第2期241-250,共10页

原生质体已被广泛应用于亚细胞定位、基因表达分析、蛋白-蛋白互作、基因编辑等方面。笔者总结了酶解法分离植物原生质体的影响因素,电穿孔和PEG介导的方法对原生质体瞬时转化效率的影响和瞬时转化的应用。植物的种类、不同的PEG浓度、... 原生质体已被广泛应用于亚细胞定位、基因表达分析、蛋白-蛋白互作、基因编辑等方面。笔者总结了酶解法分离植物原生质体的影响因素,电穿孔和PEG介导的方法对原生质体瞬时转化效率的影响和瞬时转化的应用。植物的种类、不同的PEG浓度、转染时间、DNA浓度和原生质体数量都会影响PEG介导法对原生质体瞬时转化效率。电穿孔法必须在脉冲电压、脉冲长度、脉冲数、细胞数、DNA浓度都适宜的条件下才能达到最佳转化效率。本文为更多植物原生质体分离体系和瞬时转化体系的建立提供参考。 展开更多

关键词 原生质体 酶解法 瞬时转化

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桃愈伤组织和果实瞬时转化体系的优化

9

作者 杨海清 吴凡颖 +3 位作者 王睿琦 常明明 肖婷婷 刘悦萍 《北京农学院学报》 2024年第1期13-17,57,共6页

【目的】为建立和优化桃愈伤组织和果实瞬时转化体系。【方法】筛选桃愈伤组织诱导的最佳外植体及培养条件,优化桃愈伤组织和离体果实进行农杆菌瞬时转化的体系。【结果】采用叶片、茎段和种胚为外植体均诱导出愈伤组织,叶片最高诱导率... 【目的】为建立和优化桃愈伤组织和果实瞬时转化体系。【方法】筛选桃愈伤组织诱导的最佳外植体及培养条件,优化桃愈伤组织和离体果实进行农杆菌瞬时转化的体系。【结果】采用叶片、茎段和种胚为外植体均诱导出愈伤组织,叶片最高诱导率为85.8%,用种胚诱导愈伤可达到95.8%的诱导率,且形成的愈伤组织更松散。后续的继代培养中使用4 g/L PVP处理可以缓解愈伤组织的褐化。桃愈伤组织采用浸染液法,果块采用真空和注射法均可成功转化,不同转化方法共培养3 d为荧光检测的最佳条件。【结论】优化了桃愈伤组织的诱导条件,建立了较为稳定的桃瞬时转化体系,为桃基因的快速验证奠定了技术基础。 展开更多

关键词 桃 愈伤组织 诱导 瞬时转化

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油棕叶肉原生质体分离及瞬时转化体系的建立 被引量：6

10

作者 王一菲 刘新星 +2 位作者 张青 郑育声 李东栋 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期154-159,共6页

以油棕试管苗幼嫩叶片(发芽后25 d)为材料,建立油棕叶肉原生质体分离及瞬时转化体系。取幼嫩油棕叶片在30 g/L纤维素酶和8 g/L离析酶的作用下,酶解3.5 h后,2000 r/min、4℃离心5 min得到油棕叶肉原生质体。借助绿色荧光蛋白和红色荧光... 以油棕试管苗幼嫩叶片(发芽后25 d)为材料,建立油棕叶肉原生质体分离及瞬时转化体系。取幼嫩油棕叶片在30 g/L纤维素酶和8 g/L离析酶的作用下,酶解3.5 h后,2000 r/min、4℃离心5 min得到油棕叶肉原生质体。借助绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白双质粒瞬时共转化,对油棕叶肉原生质体瞬时体系的相关参数进行优化,结果显示:当瞬时转化过程中质粒含量比为8∶1,PEG/Mg^2+溶液中PEG4000的质量浓度为200 g/L、Mg^2+溶液质量浓度为100 g/L,热激20 min,再经过20 min室温孵育,最后加入的洗液体积为2 mL时,原生质体的转化效率最高。 展开更多

关键词 油棕 试管苗 同源表达 原生质体 瞬时转化 功能验证 植株再生 亚细胞定位 蛋白质互作

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雷公藤悬浮细胞原生质体的制备及瞬时转化体系的建立 被引量：6

11

作者 胡添源 王睿 +3 位作者 陈上 马宝伟 高伟 黄璐琦 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期774-782,共9页

为探索药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)悬浮细胞原生质体提取的最优条件,并建立雷公藤原生质体瞬时转化体系,以雷公藤悬浮细胞为材料,对酶解液配比、酶解时间、甘露醇浓度及处理转速进行考察。用PEG介导的瞬时转化法将外源基因... 为探索药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)悬浮细胞原生质体提取的最优条件,并建立雷公藤原生质体瞬时转化体系,以雷公藤悬浮细胞为材料,对酶解液配比、酶解时间、甘露醇浓度及处理转速进行考察。用PEG介导的瞬时转化法将外源基因转化到雷公藤原生质体中。结果表明,以雷公藤悬浮细胞为材料提取原生质体的最佳条件是酶液配比为2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶,甘露醇浓度为0.6 mol·L–1,酶解10小时,处理转速为67×g;用PEG介导法将含有编码GFP的植物表达载体转化雷公藤悬浮细胞原生质体,激光共聚焦扫描显微镜下细胞显示绿色荧光。通过实验筛选得到雷公藤悬浮细胞原生质体的最佳提取条件,建立了雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时转化体系,为进一步开展雷公藤功能基因及合成生物学研究奠定了基础。 展开更多

关键词 原生质体 悬浮细胞 瞬时转化 雷公藤

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菠萝叶基原生质体分离与瞬时转化体系的建立

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作者 贺涵 阳习鹏 +3 位作者 赵婉欣 邵雪花 杨凤玺 刘传和 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2024年第7期81-88,98,共9页

【目的】研究菠萝叶基原生质体的高效分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为利用菠萝原生质体进行菠萝基因功能研究提供技术支持。【方法】以‘巴厘’菠萝(Ananas comosus,‘Comtede Paris’)幼嫩叶片的叶基为材料,采用3因素3水... 【目的】研究菠萝叶基原生质体的高效分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为利用菠萝原生质体进行菠萝基因功能研究提供技术支持。【方法】以‘巴厘’菠萝(Ananas comosus,‘Comtede Paris’)幼嫩叶片的叶基为材料,采用3因素3水平正交试验L _(9)(3^(3))分析纤维素酶质量浓度(6,12,20 g/L)、离析酶质量浓度(3,6,9 g/L)和甘露醇浓度(0.4,0.5,0.6 mol/L)对分离原生质体产量与活力的影响;同时,利用单因素试验(设置酶解时间2,4,6 h)筛选制备原生质体的最适酶解时间,确定分离菠萝叶基原生质体的最适条件;在最适条件下制备原生质体,采用聚乙二醇(PEG)介导法转化质粒,建立菠萝原生质体瞬时转化体系。【结果】L 9(33)正交试验结果显示,不同处理分离的原生质体产量为1.01×10^(6)~1.93×10^(6)g^(-1),纤维素酶质量浓度是决定原生质体产量的关键因素;原生质体活力为65.55%~87.00%,甘露醇浓度对原生质体活力的贡献最大。最适酶解条件为:菠萝叶基在含12 g/L纤维素酶、6 g/L离析酶、0.6 mol/L甘露醇的酶液中避光酶解4 h,产量可达1.96×10^(6)g^(-1),活力为85.54%。菠萝叶基原生质体通过PEG介导法转化pAN580-WRKY75质粒后,可在激光共聚焦显微镜下观察到核内的绿色荧光信号。【结论】确定了菠萝叶基原生质体的最适分离条件与瞬时转化方法,建立了适用于菠萝基因功能分析的原生质体瞬时表达体系。 展开更多

关键词 菠萝叶基 原生质体 瞬时转化 绿色荧光蛋白

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紫薇叶片原生质体的分离及瞬时转化 被引量：2

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作者 刘洁茹 冯露 +7 位作者 林启芳 周杨 池秀凤 蔡明 程堂仁 王佳 张启翔 潘会堂 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2023年第1期146-154,共9页

【目的】研究紫薇叶片原生质体的分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为紫薇本源物种的基因功能分析提供技术支持。【方法】以F 1株系S047(以屋久岛紫薇(L.fauriei)为母本、紫薇品种‘Pocomoke’为父本杂交获得)及‘Ebony Embers... 【目的】研究紫薇叶片原生质体的分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为紫薇本源物种的基因功能分析提供技术支持。【方法】以F 1株系S047(以屋久岛紫薇(L.fauriei)为母本、紫薇品种‘Pocomoke’为父本杂交获得)及‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’3个紫薇品种幼嫩叶片为材料,对其进行酶解,筛选最适紫薇品种,在此基础上,采用单因素试验初步筛选纤维素酶、离析酶质量浓度(5,10,15,20,25,30 g/L)及甘露醇浓度(0.4,0.6,0.8 mol/L),之后采用3因素3水平正交试验筛选纤维素酶(10,20,30 g/L)、离析酶(3,5,7 g/L)和果胶酶(2,4,6 g/L)的最适质量浓度,确定分离紫薇原生质体的最优条件。用聚乙二醇(PEG)介导法将质粒pSuper1300::GFP转化紫薇原生质体。【结果】分离原生质体的最适紫薇品种为S047株系,其在酶解过程中无褐化现象,分离液呈明亮绿色,可得到完整的原生质体;其他2个品种未分离到原生质体。单因素试验结果显示,最适的纤维素酶质量浓度为15~20 g/L,离析酶质量浓度为5~10 g/L,甘露醇浓度为0.6 mol/L。正交试验结果表明,10 g/L纤维素酶、5 g/L离析酶、4 g/L果胶酶和0.6 mol/L甘露醇混合液为最佳酶解溶液,在黑暗条件下酶解紫薇幼嫩叶片5 h,可成功分离出紫薇原生质体,其产量达28×10^(5)g^(-1),破损率为14%。将纯化的原生质体进行PEG介导的转化后,在激光共聚焦荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,表明基因转化成功。【结论】获得了紫薇叶片原生质体分离体系,并成功进行了基因瞬时转化。 展开更多

关键词 紫薇 酶解法 叶片原生质体 瞬时转化

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日本落叶松瞬时转化体系的优化及初步应用

14

作者 邢俊霞 臧巧路 +5 位作者 叶查龙 张陈谊 程冬霞 齐力旺 杨玲 李万峰 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2024年第3期129-135,共7页

[目的]优化农杆菌介导的日本落叶松胚性愈伤组织瞬时转化体系。[方法]以液体增殖培养7 d的日本落叶松胚性愈伤组织为受体材料,利用携带β-葡糖醛酸酶基因(GUS)的pCAMBIA1305.1载体进行瞬时转化,根据GUS的表达量及酶活性,筛选最佳侵染液... [目的]优化农杆菌介导的日本落叶松胚性愈伤组织瞬时转化体系。[方法]以液体增殖培养7 d的日本落叶松胚性愈伤组织为受体材料,利用携带β-葡糖醛酸酶基因(GUS)的pCAMBIA1305.1载体进行瞬时转化,根据GUS的表达量及酶活性,筛选最佳侵染液浓度、侵染时间和共培养时间。并利用筛选出的转化体系,分析落叶松scarecrow-like 6(LaSCL6)启动子的活性。[结果]瞬时转化后,GUS表达明显。当侵染液浓度OD600为0.2,侵染5 min,共培养72 h时,GUS的表达量最高,△CT值为-2.274 2;当侵染液浓度OD600为0.05,侵染5 min,共培养72 h时,GUS酶活性最高,为25.728 6 U·L^(-1)。LaSCL6启动子的活性是CaMV35S启动子的1.55倍。[结论]综合考虑GUS的表达量和酶活性,当侵染液浓度OD600为0.05,侵染5 min,共培养24 h时,GUS的表达量和酶活性较高,这一条件可以用来进行日本落叶松胚性愈伤组织的高效转化。 展开更多

关键词 落叶松 瞬时转化 胚性愈伤组织 GUS 启动子

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农杆菌介导的杜梨叶片瞬时转化方法的建立 被引量：6

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作者 李刚 宋平丽 +5 位作者 王翔 马青翠 张海霞 张玉星 许建锋 亓宝秀 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期2006-2013,共8页

【目的】探寻一种由农杆菌介导的杜梨叶片瞬时转化的最佳方法。【方法】以杜梨组织培养的幼嫩叶片为材料,将含有GUS基因的pBI121植物表达载体转化农杆菌GV3101和EHA105,设计3因子3水平正交试验L9(33),采用不同农杆菌菌液浓度、不同真空... 【目的】探寻一种由农杆菌介导的杜梨叶片瞬时转化的最佳方法。【方法】以杜梨组织培养的幼嫩叶片为材料,将含有GUS基因的pBI121植物表达载体转化农杆菌GV3101和EHA105,设计3因子3水平正交试验L9(33),采用不同农杆菌菌液浓度、不同真空渗入时间,侵染叶片组织细胞,取不同时间共培养后的叶片观察GUS染色情况。【结果】GV3101和EHA105均能高效侵染转化杜梨叶片,使GUS蛋白表达,但其转化效率不同。农杆菌GV3101在菌液OD600为0.8,真空渗入20 min,共培养4 d后,杜梨叶片的转化效率即可达到100%,且叶片坏死率仅为13.09%;EHA105在OD600为0.8,真空渗入30 min,共培养6 d,或菌液OD600为1.0,真空渗入10 min,共培养2 d的条件下转化效率最高,均为83.33%,但是,叶片坏死率分别为27.78%和15.26%,然而在菌液OD600为1.0,真空侵染时间20 min,共培养4 d后,叶片转化效率为75.79%,但叶片坏死率大大降低,仅为5.00%。【结论】菌株GV3101和EHA105均能高效侵染转化杜梨叶片,最高转化效率分别为100%和83.33%,所以菌株GV3101转化效率高于EHA105。考虑到叶片坏死率,菌株GV3101瞬时转化杜梨叶片的最适条件为:菌液OD600为0.8,真空渗入时间20 min,共培养4 d,转化效率100%,叶片坏死率13.09%;菌株EHA105瞬时转化杜梨叶片的最适条件为:菌液OD600为1.0,真空渗入20 min,共培养4 d,转化效率75.79%,叶片坏死率5.00%。 展开更多

关键词 杜梨 组织培养 叶片 农杆菌 瞬时转化 β-葡糖醛酸酶

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梨叶片原生质体制备方法的建立及其基因瞬时转化试验 被引量：1

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作者 高成昱 王艺衡 +8 位作者 靳江周 李涛 李金斗 周梦瑶 张海霞 马辉 张玉星 亓宝秀 许建锋 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1141-1150,共10页

以‘新梨7号’梨叶片为材料,探究影响原生质体分离的主要因素,制备高产优质的叶肉原生质体,并进行基因瞬时转化和表达。将继代30 d的组培苗嫩叶在最佳酶解液(1.0%纤维素酶,0.1%果胶酶,0.4%离析酶,0.5 mol·L^(-1)甘露醇,20 mmol... 以‘新梨7号’梨叶片为材料,探究影响原生质体分离的主要因素,制备高产优质的叶肉原生质体,并进行基因瞬时转化和表达。将继代30 d的组培苗嫩叶在最佳酶解液(1.0%纤维素酶,0.1%果胶酶,0.4%离析酶,0.5 mol·L^(-1)甘露醇,20 mmol·L^(-1)KCl,20 mmol·L^(-1)MES,10 mmol·L^(-1)CaCl_(2),1.0 g·L^(-1)BSA)中酶解12 h,可制备出产量为1.09×10^(6)protopl·mL^(-1)、活力为90%的原生质体。将1~2μg·mL^(-1)pROK2-GFP质粒DNA通过40%PEG-4000介导转化至上述原生质体中并培养12 h,可以观察到GFP绿色荧光信号,转化率可达40%。 展开更多

关键词 梨 叶片 原生质体制备 瞬时转化

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连翘叶片原生质体分离及瞬时转化 被引量：1

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作者 赵峥畑 张晓璐 +3 位作者 程堂仁 王佳 张启翔 潘会堂 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2023年第4期130-136,146,共8页

【目的】研究高效分离连翘叶片原生质体的条件,并以PEG介导进行瞬时转化,为连翘基因的同源表达提供技术。【方法】以金叶连翘(Forsythia koreana‘Suwon Gold’)组培苗幼嫩叶片为材料,采用4因素3水平L9(3^(4))正交试验,分析纤维素酶质... 【目的】研究高效分离连翘叶片原生质体的条件,并以PEG介导进行瞬时转化,为连翘基因的同源表达提供技术。【方法】以金叶连翘(Forsythia koreana‘Suwon Gold’)组培苗幼嫩叶片为材料,采用4因素3水平L9(3^(4))正交试验,分析纤维素酶质量浓度(15,20,25 g/L)、离析酶质量浓度(3,5,7 g/L)、甘露醇浓度(0.2,0.4,0.6 mol/L)及酶解时间(5,7,9 h)对原生质体分离的影响,探索最优酶解条件,并在此条件下分离原生质体,之后以PEG介导转化pSuper1300::GFP质粒,研究其遗传转化效果。【结果】L_(9)(34)正交试验结果显示,不同处理的金叶连翘叶片原生质体产量为1.17×10^(6)~5.71×10^(6) g^(-1),影响最大的因素为离析酶质量浓度,且4个因素对产量均有极显著影响;原生质体活力为81.19%~90.69%,影响最大的因素为离析酶质量浓度,且其对活力的影响达到显著水平。最佳酶解条件为:在20 g/L纤维素酶、5 g/L离析酶、0.2 mol/L甘露醇的混合液中酶解9 h,在此条件下原生质体产量为5.57×10^(6) g^(-1),活力为86.79%。PEG介导法结果显示,以GFP为报告基因,在转化后的金叶连翘原生质体中可以检测到绿色荧光信号。【结论】获得金叶连翘叶片原生质体分离的最佳条件,且在此条件下原生质体产量、活力较高,能够成功进行瞬时转化。 展开更多

关键词 原生质体分离 连翘叶片 瞬时转化 GFP

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拟南芥启动子rd29A在长春花中的瞬时转化及功能鉴定 被引量：5

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作者 常纯皓 王碧莹 +3 位作者 张孟夏 张适麒 王燕燕 刘志文 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期3518-3523,共6页

拟南芥诱导型启动子rd29A作为低温及盐胁迫的诱导型启动子,其在长春花中的生物学功能为长春花转基因植物的构建提供了一个可控的基因表达体系。本研究通过克隆拟南芥启动子rd29A,替换双元载体p BI121中组成型启动子Ca MV 35S构建表达载... 拟南芥诱导型启动子rd29A作为低温及盐胁迫的诱导型启动子,其在长春花中的生物学功能为长春花转基因植物的构建提供了一个可控的基因表达体系。本研究通过克隆拟南芥启动子rd29A,替换双元载体p BI121中组成型启动子Ca MV 35S构建表达载体rd29A::GUS,经根瘤农杆菌(GV3101)介导转化长春花顶端分生组织实现GUS基因在rd29A启动子驱动下的瞬时表达。表明:同常温条件(25℃)相比,经低温诱导(4℃)12 h后长春花中GUS基因表达量升高了四倍,GUS染色也同时证明了低温可成功诱导rd29A启动子在长春花中的生物学活性,进而为长春花诱导型基因表达的转基因植物构建提供了可行的理论依据。 展开更多

关键词 长春花 启动子rd29A 瞬时转化 GUS染色

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双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作 被引量：5

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作者 崔喜艳 张继晓 +3 位作者 窦瑶 孙小杰 尹悦佳 刘相国 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2013年第7期49-53,59,共6页

【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达... 【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生的黄色荧光信号。【结论】证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作。 展开更多

关键词 SSⅠ PPDK1 双分子荧光互补技术(BiFC) 瞬时转化 蛋白质互作

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大麻遗传转化研究进展 被引量：2

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作者 王思凡 蔡晓雪 +6 位作者 孟祥霄 万会花 曹雪 米要磊 徐艳琴 孙伟 陈伟强 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期2882-2889,共8页

自从乌拉圭、加拿大和美国部分州将中药“火麻仁”的基原植物大麻Cannabis sativa合法化以来,工业大麻的市场价值逐年提高。高市值推动大麻基础研究迅猛发展,其遗传转化研究也实现了质的突破。目前,发根农杆菌介导的大麻毛状根转化、根... 自从乌拉圭、加拿大和美国部分州将中药“火麻仁”的基原植物大麻Cannabis sativa合法化以来,工业大麻的市场价值逐年提高。高市值推动大麻基础研究迅猛发展,其遗传转化研究也实现了质的突破。目前,发根农杆菌介导的大麻毛状根转化、根癌农杆菌和纳米材料介导的大麻瞬时转化、病毒介导的基因沉默和大麻稳定转化均已实现,但是稳定遗传转化效率仍然不高。而建立高效的大麻遗传转化体系,不但可加速大麻分子生物学的研究,还可用于大麻新品种的创制。综述大麻遗传转化的研究进展,以期为深入开展大麻遗传转化提供参考。 展开更多

关键词 大麻 遗传转化 瞬时转化 稳定转化 基因沉默 纳米材料

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