新型冠状病毒Nsp1基因真核表达载体的构建及对宿主蛋白质翻译的影响

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作者 王宏宇 田志飘 +8 位作者 刘红线 郑亮 于雯 吴志军 Matthew Kay 高振秋 曹宏伟 耿荣庆 张华 《黑龙江八一农垦大学学报》 2024年第1期84-90,共7页

非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成... 非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成功构建SARS-CoV-2Nsp1基因的真核表达载体,并验证其抑制宿主及外源蛋白质翻译的功能。通过PCR技术扩增SARS-CoV-2Nsp1基因后,利用同源重组技术将其连接至pEGFP-N1载体上。经双酶切和测序结果鉴定,SARS-CoV-2Nsp1基因成功克隆至pEGFP-N1载体上。将重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1转染至HEK-293T细胞和HeLa细胞中,经嘌呤霉素标记后,利用Western Blot和考马斯亮蓝染色检测重组质粒的表达以及嘌呤霉素信号。结果表明,重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1在HEK-293T细胞和HeLa细胞中成功表达,并验证其抑制宿主蛋白质和外源转入细胞蛋白质的翻译,为更深入研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的功能奠定基础。 展开更多

关键词 新型冠状病毒 Nsp1基因 真核载体构建 蛋白翻译

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牛源性无乳链球菌分离鉴定及cfb基因的克隆和真核表达载体的构建 被引量：2

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作者 阚威 王华 +2 位作者 马友记 赵兴绪 张勇 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2014年第5期39-44,共6页

为研制奶牛乳房炎无乳链球菌的基因工程疫苗,采集隐性奶牛乳房炎奶样,利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择培养基和色素试验,并结合无乳链球菌种属特异性基因cfb,采用PCR技术从隐性乳房炎奶样中分离和鉴定无乳链球菌。根据GenBank已报... 为研制奶牛乳房炎无乳链球菌的基因工程疫苗,采集隐性奶牛乳房炎奶样,利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择培养基和色素试验,并结合无乳链球菌种属特异性基因cfb,采用PCR技术从隐性乳房炎奶样中分离和鉴定无乳链球菌。根据GenBank已报道的链球菌cfb基因序列,经ORF分析和B细胞表位预测,利用Primer 5.0软件设计cfb因子富含B细胞表位区域引物,添加酶切位点和真核表达元件,以分离株无乳链球菌的基因组为模板,PCR扩增cfb基因并连接T载体克隆测序,经测序确定无误后,连接pcDNATM3.1 V5-His A(pcDNA-cfb)真核载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒进行酶切和测序鉴定。结果显示,从89份隐性奶牛乳房炎奶样中分离得到8株无乳链球菌,成功构建了真核表达载体(pcDNA-cfb)。THB和色素试验初步筛选,可以作为快速分离无乳链球菌的一种方法,利用Bcepred和Lasergene-Protean软件对分离得到的无乳链球菌cfb基因序列分析,在所克隆的cfb基因序列内有多个优势抗原表位,因此,有望作为无乳链球菌基因工程疫苗研制的抗原靶标基因序列,为进一步研究其基因工程疫苗提供基础条件。 展开更多

关键词 奶牛隐性乳房炎 无乳链球菌 cfb基因 真核载体构建

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EZH2的小干扰RNA真核表达载体的构建及其在膀胱癌T24细胞系稳定表达的研究 被引量：1

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作者 王海峰 杨宏 +5 位作者 胡礼炳 雷永虹 秦扬 李俊 毕城伟 霍倩 《中国全科医学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第33期3927-3929,共3页

目的构建EZH2的小干扰RNA(siRNA2)真核表达载体质粒,获得稳定表达干扰质粒的膀胱癌细胞系,并探讨EZH2在膀胱癌中的作用。方法通过合成特异性沉默EZH2的siRNA2片段,获得pEGFP-C1-siEZH2表达载体;脂质体介导重组质粒转染T24细胞,经G418加... 目的构建EZH2的小干扰RNA(siRNA2)真核表达载体质粒,获得稳定表达干扰质粒的膀胱癌细胞系,并探讨EZH2在膀胱癌中的作用。方法通过合成特异性沉默EZH2的siRNA2片段,获得pEGFP-C1-siEZH2表达载体;脂质体介导重组质粒转染T24细胞,经G418加压筛选获得稳定转染细胞株,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测转染后细胞系T24 EZH2的表达。结果经测序证明重组载体构建成功,稳定转染siRNA2的T24细胞EZH2的mRNA和蛋白水平均较空白对照组下降(P<0.01)。结论成功构建EZH2的siRNA2真核表达载体,获得EZH2稳定沉默的T24细胞系,为进一步研究以EZH2为靶点的膀胱癌基因治疗奠定实验基础。 展开更多

关键词 EZH2 膀胱肿瘤 RNA干扰 真核载体构建

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新型冠状病毒E基因真核表达载体的构建及表达

4

作者 于雯 郑亮 +4 位作者 王宏宇 高鑫誉 吴志军 曹宏伟 张华 《黑龙江八一农垦大学学报》 2022年第5期85-91,共7页

囊膜蛋白(E蛋白)是新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2,SARS-CoV-2)的小包膜蛋白,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为了更有利地研究SARS-CoV-2 E蛋白的生物学功能,研究成功构建了SARS-CoV-2 E基因的真... 囊膜蛋白(E蛋白)是新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2,SARS-CoV-2)的小包膜蛋白,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为了更有利地研究SARS-CoV-2 E蛋白的生物学功能,研究成功构建了SARS-CoV-2 E基因的真核表达载体。首先,通过PCR技术扩增SARS-CoV-2 E基因,并将pCMV-Myc载体进行双酶切。随后,利用同源重组将SARS-CoV-2 E基因连接至pCMV-Myc载体。经酶切和测序鉴定发现,SARS-CoV-2 E基因成功克隆至pCMV-Myc载体中,并将重组质粒命名为pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E。将重组质粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E转染至HEK-293T细胞,利用Western Blot和间接免疫荧光技术检测重组质粒的表达以及定位情况。结果表明,重组质粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E在HEK-293T细胞中成功表达,并且发现重组蛋白主要分布于胞质,少量存在于胞核,为进一步研究SARS-CoV-2 E蛋白的功能奠定基础。 展开更多

关键词 新型冠状病毒 E基因 真核载体构建 蛋白表达

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人14-3-3β蛋白的原核表达、抗血清制备及真核表达载体的构建

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作者 杨学习 孙敏英 +2 位作者 马瑞娟 徐伟文 李明 《中华神经医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1081-1085,共5页

目的纯化原核表达的14-3-3β（YWHAB）重组蛋白并制备多抗血清，构建适用于哺乳动物细胞的真核表达载体。方法将重组蛋白表达载体pET30a（＋）／YWHAB转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞，异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱... 目的纯化原核表达的14-3-3β（YWHAB）重组蛋白并制备多抗血清，构建适用于哺乳动物细胞的真核表达载体。方法将重组蛋白表达载体pET30a（＋）／YWHAB转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞，异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，镍-四齿螯合剂mi_NTA）亲和层析柱纯化重组蛋白；以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，应用ELISA和Western blot方法分别检测抗血清的效价和特异性；应用PCR扩增添加BamHI和EcoRI酶切位点把YWHAB的ORF亚克隆至真核表达载体pEGFP-N1，添加BamHI和HindllI酶切位点把YWHAB的开放阅读框（ORF）亚克隆至真核表达载体pCDNA3．1（＋），对重组载体进行酶切和PCR鉴定。结果YWHAB重组蛋白以可溶性形式表达，分子量为32000，与预期分子量一致；纯化后的重组蛋白纯度达90％以上，ELISA结果显示其抗血清的效价为1：50000，Western blot结果表明抗血清的特异性较好：酶切和PCR鉴定结果表明真核表达载体pEGFP-N1／YWHAB和pCDNA3．1（＋）／YWHAB构建成功。结论通过亲和层析纯化获得人14—3—3β重组蛋白，进而免疫BALB／c小鼠制备多抗血清．为进一步研究人14-3-3β的功能成功构建了其真核表达载体。 展开更多

关键词 14—3—3β 原核表达 纯化 抗血清 真核载体构建

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内江猪γ干扰素基因的克隆、序列分析及真核表达载体的构建 被引量：9

6

作者 黄亚平 郭万柱 李晓琪 《中国畜牧兽医》 CAS 2007年第5期60-63,共4页

将内江猪的外周血淋巴细胞在刀豆素(ConA)的刺激下培养24 h后,提取总RNA,应用一步法RT-PCR扩增γ干扰素(IFN-γ)cDNA,克隆到PMD18-T载体,命名为pMD-N-IFN-γ,测序结果证明克隆的cDNA全长603 bp,其ORF为501bp,编码166个氨基酸,与Genbank... 将内江猪的外周血淋巴细胞在刀豆素(ConA)的刺激下培养24 h后,提取总RNA,应用一步法RT-PCR扩增γ干扰素(IFN-γ)cDNA,克隆到PMD18-T载体,命名为pMD-N-IFN-γ,测序结果证明克隆的cDNA全长603 bp,其ORF为501bp,编码166个氨基酸,与Genbank公布的IFN-γ比对,核苷酸同源性在99.4%以上,从而证实成功地克隆了内江猪IFN-γ基因。以pMD-N-IFN-γ质粒为模板亚克隆完整ORF区,连接到真核表达质粒pcDNA3.1(+)的EcoRI、XhoI两位点之间,经单双酶切鉴定,成功的构建了IFN-γ真核表达载体pcDNA3.1(+)-N-IFN-γs。 展开更多

关键词 Γ干扰素 克隆 序列分析 真核表达载体构建

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人lrg真核表达载体的构建和初步分析 被引量：5

7

作者 杜可军 柴玉波 +5 位作者 常文辉 段小红 侯理朝 陈南春 林树新 陈苏民 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 2004年第4期179-182,共4页

目的 :在真核细胞中表达人lrg基因。 方法 :构建野生型人lrg的真核表达载体 ,体外转染肝癌细胞系HepG2 ,并进行稳定筛选。用WesternBlot、SABC -FITC进行人lrg基因表达的鉴定。 结果 :成功构建了人lrg的真核表达载体 pcDNA3.1( + ) /hlr... 目的 :在真核细胞中表达人lrg基因。 方法 :构建野生型人lrg的真核表达载体 ,体外转染肝癌细胞系HepG2 ,并进行稳定筛选。用WesternBlot、SABC -FITC进行人lrg基因表达的鉴定。 结果 :成功构建了人lrg的真核表达载体 pcDNA3.1( + ) /hlrg ,WesternBlot和SABC -FITC等实验表明该基因在HepG2中进行了表达。结论 :在HepG2中稳定表达了 pcDNA3.1( + ) /hlrg ,为深入探讨人lrg基因的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 人lrg基因 真核表达载体构建 HEPG2细胞

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镇痛抗肿瘤肽基因真核表达载体构建及其体外抗肝细胞癌作用 被引量：3

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作者 金思思 吴金明 +2 位作者 黄智铭 吴建胜 申苏建 《中华内科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期154-156,共3页

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在我国的发病率及病死率均高。西医治疗肿瘤有起效快的优点，但往往有较大的副作用和局限性。我国传统中药中许多成分具有抗肿瘤作用，作为中药蝎毒成分之一的东亚钳蝎镇痛抗肿瘤肽（analgesi... 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在我国的发病率及病死率均高。西医治疗肿瘤有起效快的优点，但往往有较大的副作用和局限性。我国传统中药中许多成分具有抗肿瘤作用，作为中药蝎毒成分之一的东亚钳蝎镇痛抗肿瘤肽（analgesic—antitumor peptide，AGAP）近来备受关注，将其与现代生物技术结合开发新的抗肿瘤药物具有很好的发展前景。本研究通过构建甲胎蛋白（AFP）启动子及增强子调控的AGAP真核表达载体，观察其对HCC的治疗作用，为蝎毒在肝癌基因治疗方面的价值提供实验依据。 展开更多

关键词 真核表达载体构建 抗肿瘤作用 肝细胞癌 镇痛 肽基因 carcinoma peptide 体外

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胆汁酸膜受体TGR5真核表达载体的构建及在细胞中的表达 被引量：3

9

作者 史琳凯 刘倩 +4 位作者 张子英 刘畅 王旭东 丁月霞 李培锋 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第5期17-22,共6页

试验旨在构建胆汁酸膜受体TGR5真核表达载体,转染293T细胞并在其中表达。用RT-PCR技术从胎盘组织中得到TGR5基因,克隆至真核表达载体pCMV-EGFP中。双酶切和测序鉴定正确后,将pCMV-EGFP-TGR5瞬时转染293T细胞,并采用实时荧光定量PCR和Wes... 试验旨在构建胆汁酸膜受体TGR5真核表达载体,转染293T细胞并在其中表达。用RT-PCR技术从胎盘组织中得到TGR5基因,克隆至真核表达载体pCMV-EGFP中。双酶切和测序鉴定正确后,将pCMV-EGFP-TGR5瞬时转染293T细胞,并采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测TGR5的表达。结果显示,本试验构建了TGR5真核表达载体pCMV-EGFP-TGR5;转染293T细胞后,荧光显微镜观察到绿色荧光表达;实时荧光定量PCR检测TGR5表达量显著增加;Western blotting结果显示有目的蛋白表达。结果表明,真核表达载体pCMV-EGFP-TGR5构建成功,转染293T细胞后在基因、蛋白水平上均表达TGR5受体。 展开更多

关键词 TGR5基因 克隆 真核表达载体构建

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基因重组免疫毒素白细胞介素18-PE38融合基因治疗类风湿性关节炎的初步研究 被引量：2

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作者 吴瑕 杨春蕾 +3 位作者 张林 李虹 陶大昌 屈艺 《中国修复重建外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期306-309,共4页

目的　构建白细胞介素18(interleukin18,IL- 18) - PE38融合基因的真核表达载体,并研究其在小鼠软骨细胞及3T3细胞中的表达,探讨类风湿性关节炎的基因治疗方法。　方法　经限制性内切酶双酶切从质粒PRKL4 5 9K- IL18- PE38中获取IL- 18-... 目的　构建白细胞介素18(interleukin18,IL- 18) - PE38融合基因的真核表达载体,并研究其在小鼠软骨细胞及3T3细胞中的表达,探讨类风湿性关节炎的基因治疗方法。　方法　经限制性内切酶双酶切从质粒PRKL4 5 9K- IL18- PE38中获取IL- 18- PE38融合基因,将其与真核表达载体Psec Tag2 B连接,转化感受态菌,挑取单克隆培养并提取质粒,Eco R 单酶切鉴定。脂质体转染法将构建的真核表达载体转染入3T3细胞及小鼠软骨细胞中,分别设置空载体对照,通过荧光免疫细胞化学法鉴定转染后瞬时表达情况。　结果　Eco R 单酶切后电泳鉴定显示,所构建的真核表达载体Psec Tag2 B- IL- 18- PE38片段长度约为6 0 0 0 bp。荧光免疫细胞化学法、荧光显微镜摄片均显示转染融合基因组荧光表达强,空载体对照组荧光表达微弱。　结论　IL- 18- PE38融合基因真核表达载体构建成功,并在小鼠软骨细胞及3T3细胞中表达,为类风湿性关节炎的基因治疗研究奠定基础。 展开更多

关键词 类风湿性关节炎 白细胞介素 融合基因治疗 重组免疫毒素 免疫细胞化学法 步研究 PsecTag2B 真核表达载体构建 3T3细胞 EcoRⅠ 软骨细胞 基因治疗方法 限制性内切酶 脂质体转染法 荧光显微镜 克隆培养 酶切鉴定 表达情况

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Pdx-1真核表达载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达 被引量：2

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作者 辛宁 赵志刚 +1 位作者 袁慧娟 李杰 《中国实用医刊》 2010年第10期1-4,共5页

目的 构建含有胰腺-十二指肠同源盒-1(Pdx-1)的真核表达载体,并研究其在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达情况.方法 克隆Pdx-1基因,构建含Pdx-1的真核表达载体pEGFP-Pdx-1及pcDNA3.1-Pdx-1,转染MSCs,倒置荧光显微镜及逆转录聚合酶链... 目的 构建含有胰腺-十二指肠同源盒-1(Pdx-1)的真核表达载体,并研究其在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达情况.方法 克隆Pdx-1基因,构建含Pdx-1的真核表达载体pEGFP-Pdx-1及pcDNA3.1-Pdx-1,转染MSCs,倒置荧光显微镜及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MSCs中Pdx-1的表达.结果 测序结果 表明克隆的Pdx-1基因序列正确,构建的含Pdx-1的真核表达载体能有效的转染MSCs,并检测到该基因mRNA的表达.结论 完成Pdx-1基因克隆,成功构建含有Pdx-1基因真核表达载体,并在转化株中检测到该基因的表达,为糖尿病的细胞替代及基因治疗提供基础. 展开更多

关键词 Pdx-1基因 真核表达载体构建 大鼠 骨髓间充质干细胞 mesenchymal stem cells EUKARYOTIC EXPRESSION vector MSCs 逆转录聚合酶链反应 GENE EXPRESSION 倒置荧光显微镜 results GENE sequence 克隆 检测 RT-PCR GENE therapy fluorescence completion 转染 细胞替代

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长白猪CIDEB基因真核表达载体构建及生物信息学分析 被引量：1

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作者 孙健 郭振清 +2 位作者 王丽敏 杜金友 李红强 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2020年第3期61-66,共6页

本研究旨在从长白猪肝脏组织中克隆与脂质存储相关的CIDEB基因编码区全长序列,并进行生物信息学分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据NCBI中的猪CIDEB基因mRNA序列(登录号:NM001112688.1)设计特异性引物,采集长白猪新鲜的肝脏组织,提... 本研究旨在从长白猪肝脏组织中克隆与脂质存储相关的CIDEB基因编码区全长序列,并进行生物信息学分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据NCBI中的猪CIDEB基因mRNA序列(登录号:NM001112688.1)设计特异性引物,采集长白猪新鲜的肝脏组织,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物与pcDNA3.1+载体连接,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆后进行生物信息学分析。结果显示:长白猪CIDEB基因编码区序列全长为660 bp,编码了219个氨基酸,与人同源性最高,为92.2%。对长白猪CIDEB蛋白进行生物信息学分析表明,CIDEB蛋白属于亲水性蛋白,不存在跨膜结构,属于CIDE-N家族成员之一,不同物种的CIDEB蛋白具有很高的保守性,其二级结构α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占44.29%、18.26%、8.22%、29.22%。本实验成功构建了CIDEB基因的全长真核表达载体,并对其核苷酸、氨基酸进行序列分析,为进一步研究和揭示长白猪CIDEB蛋白的结构与功能提供了基础材料。 展开更多

关键词 CIDEB 长白猪 真核表达载体构建 生物信息学分析

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共表达自杀基因联合细胞因子基因的泌尿组织特异性真核表达载体构建及鉴定

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作者 邹源 田俊强 +5 位作者 陶燕 洪梅 卢建中 付生军 马宝良 王志平 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1539-1540,共2页

单纯疱疹病毒胸腺激酶基因（HSV—TK）是自杀基因中较有前途的一种，将其导人肿瘤细胞后，配合前体药物更昔洛韦（GCV）可干扰DNA的正常合成和细胞增殖。尿路斑块蛋白2（UPII）启动子是一种组织特异性启动子，在膀胱癌中的启动活性明显... 单纯疱疹病毒胸腺激酶基因（HSV—TK）是自杀基因中较有前途的一种，将其导人肿瘤细胞后，配合前体药物更昔洛韦（GCV）可干扰DNA的正常合成和细胞增殖。尿路斑块蛋白2（UPII）启动子是一种组织特异性启动子，在膀胱癌中的启动活性明显高于其他组织细胞。白细胞介素（IL）-2是1种重要的免疫调节因子，可诱导较强的抗肿瘤免疫应答。 展开更多

关键词 组织特异性启动子 真核表达载体构建 自杀基因 细胞因子基因 共表达 抗肿瘤免疫应答 鉴定 泌尿

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牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价 被引量：1

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作者 孙修勤 郑风荣 +4 位作者 李继业 吴兴安 曲凌云 张进兴 洪旭光 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期740-745,共6页

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白（MCP）0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将... 用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白（MCP）0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用. 展开更多

关键词 淋巴囊肿病毒(LCDV) 核酸疫苗 真核表达载体构建 免疫效果

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转KAP6.1-GFP-蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S绵羊成纤维细胞株的筛选 被引量：1

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作者 王春生 原璐 +3 位作者 宁方勇 吴治昊 朴善花 安铁洙 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期2561-2566,共6页

【目的】通过体细胞核移植为获得皮肤特异表达蜘蛛拖丝蛋白的绵羊奠定基础。【方法】将pcDNA3.1和带有角蛋白结合蛋白启动子质粒pGM-T-KAP6.1分别用BglⅡ和Hin dⅢ双酶切后连接,再与蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S连接,最后通过酶切与pIRES... 【目的】通过体细胞核移植为获得皮肤特异表达蜘蛛拖丝蛋白的绵羊奠定基础。【方法】将pcDNA3.1和带有角蛋白结合蛋白启动子质粒pGM-T-KAP6.1分别用BglⅡ和Hin dⅢ双酶切后连接,再与蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S连接,最后通过酶切与pIRES2-EGFP质粒连接后构建真核表达载体pIRES2-EGFP-4S;将此载体线性化后,采用脂质体法转染绵羊皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因阳性细胞。【结果】筛选得到转pIRES2-EGFP-4S的阳性细胞。对阳性细胞经体外培养后的检测显示:(1)细胞形态(长梭形)、细胞生长曲线(呈S形)、群体倍增时间(随培养时间增加逐渐缩短)和细胞接种率(细胞贴壁率及存活率在24 h内逐渐升高,并达到最高值125%)等均具有正常绵羊成纤维细胞的生物学特征;(2)阳性细胞经冷冻复苏后具有与新鲜阳性细胞相似的生物学特征;(3)PCR检测结果显示,pIRES2-EGFP-4S在阳性细胞的基因组中整合。【结论】获得具有在绵羊皮肤特异表达,且便于检测的转蜘蛛拖丝蛋白4S的绵羊成纤维细胞株。 展开更多

关键词 蜘蛛拖丝蛋白基因 角蛋白启动子 真核表达载体构建 绵羊成纤维细胞 转基因

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载脂蛋白M基因真核表达载体构建及其对HBV复制的影响 被引量：1

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作者 刘兴晖 祝成亮 +2 位作者 宋惠 王艳 李毅 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2011年第8期943-944,共2页

载脂蛋白（apolipoprotein,apo）是脂蛋白中的蛋白成分,主要由肝细胞合成,是正常脂蛋白颗粒的装配和分泌所必需的。载脂蛋白M（apoM）是高密度脂蛋白（HDL）胆固醇的主要成分之一,参与HDL的合成和分泌[1]。研究表明HBV感染患者apoM血清... 载脂蛋白（apolipoprotein,apo）是脂蛋白中的蛋白成分,主要由肝细胞合成,是正常脂蛋白颗粒的装配和分泌所必需的。载脂蛋白M（apoM）是高密度脂蛋白（HDL）胆固醇的主要成分之一,参与HDL的合成和分泌[1]。研究表明HBV感染患者apoM血清学水平升高[2],但apoM能否影响HBV的复制还不清楚。本研究通过构建apoM的真核表达载体,探讨apoM对HBV复制的影响。 展开更多

关键词 真核表达载体构建 HBV复制 载脂蛋白 M基因 HBV感染患者 肝细胞合成 APOM 高密度脂蛋白

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绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测 被引量：1

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作者 孟庆文 曹素芳 +2 位作者 李媛 金红 于康震 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 2000年第S1期44-45,共2页

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ，并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_... 拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ，并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3，以ＢａｍＨⅠ鉴定方向，以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ，经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆，荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ，并成功转染ＭＤＣＫ，在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达，并发出绿色荧光，是一良好的报告基因和筛选标记。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白 真核表达载体构建 表达检测

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牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建 被引量：1

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作者 康峰 苏广华 +3 位作者 苏建国 段彪 王子东 李光鹏 《中国牛业科学》 2011年第5期9-12,共4页

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因(Follistatin,FSTN)基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载... [目的]克隆牛的卵泡抑素基因(Follistatin,FSTN)基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结果]经酶切及PCR鉴定表明成功构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP1-FSTN。[结论]成功构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP1-FSTN,为促进肌肉生长的转基因优质肉牛品种培育奠定了基础。 展开更多

关键词 牛卵泡抑素基因 基因克隆 真核表达载体构建

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水牛KDM1A/LSD1基因的克隆分析及真核表达载体的构建 被引量：1

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作者 赵鑫 俸云 +2 位作者 沈朋雷 石德顺 陆凤花 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2019年第7期14-20,25,共8页

本研究旨在对水牛组蛋白去甲基化酶KDM1A基因进行克隆,分析并构建真核表达载体,为研究其在水牛体细胞克隆胚胎中的作用提供基础。首先提取水牛卵巢总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到水牛KDM1A基因并对其进行生物信息学分析。结果表明:水牛KD... 本研究旨在对水牛组蛋白去甲基化酶KDM1A基因进行克隆,分析并构建真核表达载体,为研究其在水牛体细胞克隆胚胎中的作用提供基础。首先提取水牛卵巢总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到水牛KDM1A基因并对其进行生物信息学分析。结果表明:水牛KDM1A基因编码区全长2 625 bp,预测编码874个氨基酸;水牛KDM1A与其他物种同源性较高且与生物分类学保持一致;其所编码蛋白分子式为C2375H3855N805O776S24,理论分子质量为56 872.11;其二级结构由19个α螺旋,47个β折叠,25个T转角和无规则卷曲组成;其高级结构在水牛、黄牛、人之间具有较高的相似性;本实验构建了水牛pcDNA3.1(+)-KDM1A真核表达载体,转染pcDNA3.1(+)-KDM1A可以显著提高水牛耳部成纤维细胞(BFFs)中KDM1A的表达水平;还发现卵母细胞中KDM1A的表达水平显著高于BFFs。 展开更多

关键词 水牛 KDM1A基因 克隆分析 真核表达载体构建

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抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建 被引量：1

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作者 陈金顶 赵明秋 +2 位作者 索青利 黄青云 廖明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期164-166,170,共4页

根据抗体重链与轻链基因的核苷酸序列设计并合成了1对引物,以猪外周血淋巴细胞基因组mRNA为模板,通过RT_PCR方法获得了一大小约85bp的DNA片段,并将其克隆到pGEM_T载体上进行序列测定,测序结果显示,猪抗体信号肽基因核苷酸序列长度为57bp... 根据抗体重链与轻链基因的核苷酸序列设计并合成了1对引物,以猪外周血淋巴细胞基因组mRNA为模板,通过RT_PCR方法获得了一大小约85bp的DNA片段,并将其克隆到pGEM_T载体上进行序列测定,测序结果显示,猪抗体信号肽基因核苷酸序列长度为57bp,编码19个氨基酸,核苷酸及推导的氨基酸序列与已发表的抗体信号肽基因序列一致,同时在信号肽基因3’端下游提供可供肽酶切割的窗口和外源基因的克隆位点。然后将信号肽基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,成功构建了一含信号肽序列的真核表达载体3.1_SFc,为外源基因在pcDNA3.1(+)中的表达与分泌提供了一有效的信号肽,也为研究基因的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 抗体信号肽 基因克隆 序列测定 真核表达载体构建 蛋白质

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