启动子克隆方法研究进展 被引量：20

1

作者 李姗姗 迟彦 +4 位作者 李凌飞 马玺 平文祥 于冲 周东坡 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期9-16,共8页

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子的克隆对于构建基因工程载体,表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应用,此后... 启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子的克隆对于构建基因工程载体,表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应用,此后相继问世的一些基于PCR法的克隆启动子技术,像I-PCR、P-PCR、SSP-PCR、YADE、TAIL-PCR等,为克隆启动子提供了更可靠,更合理的方法。对这几种方法进行了简要综述,比较了不同方法的优缺点,并展望了今后的研究前景。 展开更多

关键词 研究进展 克隆方法 启动子探针型载体 TAIL-PCR SSP-PCR 基因表达调控 基因工程载体 启动子克隆 PCR方法 顺式元件 组成部分 表达载体 目的蛋白 PCR法 研究前景 优缺点

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HIV-Tat蛋白转导域在医学研究中的应用 被引量：8

2

作者 丁劲 马斌 +1 位作者 刘军 薛采芳 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2003年第6期6-8,13,共4页

HIV Tat蛋白转导域 (proteintransductiondomain ,PTD)是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域 ,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞 ,甚至可以通过血脑屏障 ,转导效率很高... HIV Tat蛋白转导域 (proteintransductiondomain ,PTD)是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域 ,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞 ,甚至可以通过血脑屏障 ,转导效率很高而且对细胞没有损伤。TAT融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具 。 展开更多

关键词 HIV-Tat蛋白转导域 人免疫缺陷病毒反式激活蛋白 生物膜 运载工具 目的蛋白

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用乳糖作为诱导剂进行重组蛋白的表达 被引量：11

3

作者 郝淑美 王宣军 +3 位作者 张秀霞 方勇 关晓峰 盛军 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第5期409-411,共3页

目的研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达。方法以表达SARS刺突蛋白片段的工程菌BL21(DE3)/S为模型菌株,采用葡萄糖、甘油作为碳源,不同浓度的乳糖和异乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。在40L发酵罐中进行验证。结果... 目的研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达。方法以表达SARS刺突蛋白片段的工程菌BL21(DE3)/S为模型菌株,采用葡萄糖、甘油作为碳源,不同浓度的乳糖和异乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。在40L发酵罐中进行验证。结果在摇瓶实验中,乳糖浓度大于0.5mmol/L即可以很好地诱导目的蛋白的表达,表达量与IPTG诱导时相当;葡萄糖的存在可以抑制乳糖,但不能抑制异乳糖的诱导作用;使用甘油作为碳源,既不抑制乳糖,也不抑制异乳糖的诱导作用。在发酵罐实验中,诱导初始阶段葡糖糖的存在抑制乳糖的诱导作用。结论在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导阶段应采用非葡萄糖碳源。 展开更多

关键词 乳糖操纵子 葡萄糖 诱导 重组蛋白 诱导剂 乳糖 诱导作用 SARS 目的蛋白 IPTG

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美洲大蠊主要变应原的纯化与免疫学鉴定 被引量：7

4

作者 胡川 刘志刚 +2 位作者 林立丰 阴伟雄 李金生 《寄生虫与医学昆虫学报》 CAS 2005年第3期163-167,共5页

为利用蛋白纯化技术获得较高纯度美洲大蠊天然主要变应原,以进一步提高临床诊断的特异性和免疫治疗疗效。美洲大蠊全虫粗浸液通过DE-52离子交换层析、HiprepSephacrylS-200凝胶过滤层析等分离步骤得到了纯度为90%的目的蛋白,回收率为26%... 为利用蛋白纯化技术获得较高纯度美洲大蠊天然主要变应原,以进一步提高临床诊断的特异性和免疫治疗疗效。美洲大蠊全虫粗浸液通过DE-52离子交换层析、HiprepSephacrylS-200凝胶过滤层析等分离步骤得到了纯度为90%的目的蛋白,回收率为26%,经WesternBlotting分析74kDa的蛋白质具有免疫原性,为变应原疫苗的纯化和标准化奠定了基础。 展开更多

关键词 美洲大蠊 变应原 层析 鉴定 纯化 美洲大蠊 纯化技术 免疫学 Western 鉴定 离子交换层析 凝胶过滤层析 目的蛋白 免疫治疗

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蛋白质提纯的研究进展 被引量：5

5

作者 蒋梅 杨仕标 +2 位作者 王秀琼 赵俊 张念祖 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2008年第3期25-26,共2页

关键词 蛋白质提取 基因克隆与表达 提纯 生物学活性 生物学作用 目的蛋白 生物制品 疾病治疗

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重组腺相关病毒感染细胞后目的蛋白表达水平检测方法的建立及验证

6

作者 裴德宁 闫书美 +3 位作者 史新昌 胡倩 周勇 刘宾 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第6期646-650,655,共6页

目的建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)感染细胞后目的蛋白表达水平的检测方法,并进行方法验证,以期用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控。方法将rAAV9供试品用感染增强剂Envirus-AAV处理后,感染经... 目的建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)感染细胞后目的蛋白表达水平的检测方法,并进行方法验证,以期用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控。方法将rAAV9供试品用感染增强剂Envirus-AAV处理后,感染经羟基脲(hydroxyurea,HU)作用的人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87-MG,以rAAV9参考品为标准,采用ELISA法检测细胞中目的蛋白戊二酰辅酶A脱氢酶(glutaryl-CoA dehydrogenase,GCDH)的表达水平,并验证方法的专属性、准确性、精密性、线性范围、定量限及耐用性。采用建立的方法检测8批rAAV9供试品。结果供试品缓冲液的A_(450)-A_(630)为0.3,略低于蛋白定量四参数标准曲线最低稀释点(1 ng/mL);150%、100%、50%理论相对效价水平样品平均回收率均在100.0%~107.3%范围内;同1名实验员重复3次及不同实验员检测3个理论相对效价水平样品的目的蛋白表达水平RSD均<25%;rAAV9供试品在50%~150%理论相对效价水平范围内,与相应的目的蛋白表达水平呈良好的线性关系,直线回归方程为y=1.077 x-0.022,R~2为0.984;方法的定量限为0.59,即6.0×10^(12)vg/mL;U87-MG细胞用HU孵育不同时间(18、21、24 h)、细胞培养上清液于不同条件(室温放置0.5 h、-60℃以下放置12 h、-60℃以下放置24 h)保存后,目的蛋白表达水平RSD均<25%。1~8批rAAV9供试品目的蛋白表达水平分别为111%、121%、72%、65%、86%、75%、102%、91%。结论建立的rAAV感染细胞后目的蛋白表达水平检测方法具有良好的专属性、准确性、精密性及耐用性,可用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控。 展开更多

关键词 重组腺相关病毒 人脑星形胶质母细胞瘤细胞 目的蛋白 羟基脲 感染增强剂 酶联免疫吸附试验

原文传递

出血性大肠杆菌O157 eae-stx1/2B融合基因的构建和表达 被引量：3

7

作者 陈萍 刘军 +5 位作者 祝令伟 孙洋 郭学军 齐翀 冯书章 郑明光 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期270-272,共3页

构建表达eae和stx1/2B的融合基因,克隆eae基因的C端280个氨基酸残基(Int280)基因部分,以正确地阅读框定向插入到含有stx1/2B融合基因的质粒,构建重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了... 构建表达eae和stx1/2B的融合基因,克隆eae基因的C端280个氨基酸残基(Int280)基因部分,以正确地阅读框定向插入到含有stx1/2B融合基因的质粒,构建重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达。薄层扫描分析表明目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的50.67%。由于该融合蛋白由eae、stx1B、stx2B等三部分抗原组成,可刺激机体产生针对紧密素和StxB的抗体,在E-HECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。 展开更多

关键词 大肠杆菌O157 融合基因 构建 出血性 融合蛋白 氨基酸残基 总蛋白含量 单克隆抗体 亚单位疫苗 重组质粒 诱导表达 IPTG 电泳检测 PAGE 高效表达 目的蛋白 薄层扫描 E基因 SDS 表达量 分析表 C端

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志贺毒素B(ShT-B)亚单位基因的克隆、表达与纯化

8

作者 喻华英 高丰 +1 位作者 贾桂珍 吴东林 《塔里木大学学报》 2005年第1期1-4,共4页

用KpnⅠ和HindⅢ双酶切pGEM-TB3 克隆质粒,得到为225bp成熟ShT-B基因片段,将其插入到经同样双酶切的pQE30表达载体中,构建了ShT-B的重组表达质粒pQE30-B2,转化到E.coliM15,经IPTG诱导后,重组质粒目的蛋白均得到表达表达蛋白约占菌体总... 用KpnⅠ和HindⅢ双酶切pGEM-TB3 克隆质粒,得到为225bp成熟ShT-B基因片段,将其插入到经同样双酶切的pQE30表达载体中,构建了ShT-B的重组表达质粒pQE30-B2,转化到E.coliM15,经IPTG诱导后,重组质粒目的蛋白均得到表达表达蛋白约占菌体总蛋白的16%,主要为可溶性形式,约9. 2%。为重组抗原的制备提供了必要的物质基础。 展开更多

关键词 亚单位基因 志贺毒素 克隆 纯化 重组表达质粒 E.COLI 基因片段 表达载体 IPTG 目的蛋白 重组质粒 物质基础 重组抗原 双酶切 ShT M15 总蛋白 可溶性 成熟

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人工饲料育家蚕/杆状病毒表达猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因 被引量：2

9

作者 郑小坚 缪竞诚 +3 位作者 曹广力 朱江 顾全丰 沈卫德 《苏州大学学报（自然科学版）》 CAS 2005年第2期77-80,共4页

以重组病毒Bm-BacPAK6-E2接种全龄人工饲料育及5龄桑叶育家蚕皓月×菁松幼虫、蛹,观察重组病毒的感染发病情况,调查病蚕、蛹的采血量并进行SDS-PAGE分析.结果表明,全龄人工饲料育家蚕接种重组病毒的成功率、采血量等指标均与5龄桑... 以重组病毒Bm-BacPAK6-E2接种全龄人工饲料育及5龄桑叶育家蚕皓月×菁松幼虫、蛹,观察重组病毒的感染发病情况,调查病蚕、蛹的采血量并进行SDS-PAGE分析.结果表明,全龄人工饲料育家蚕接种重组病毒的成功率、采血量等指标均与5龄桑叶育相近,SDS-PAGE蛋白质电泳在家蚕幼虫、蛹血淋巴中均检测到1条与目的蛋白理论分子量(63 kD)相符的特异性蛋白条带,初步认为是重组病毒Bm-BacPAK6-E2的融合表达产物. 展开更多

关键词 人工饲料育 杆状病毒表达 囊膜糖蛋白 E2基因 猪瘟病毒 SDS-PAGE分析 重组病毒 蛋白质电泳 特异性蛋白 发病情况 家蚕幼虫 目的蛋白 表达产物 分子量 桑叶 接种 血量 菁松 皓月 蛹

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大肠杆菌工程菌发酵工艺中诱导条件的研究 被引量：1

10

作者 王晓洲 刘丹 《四川文理学院学报》 2010年第2期46-48,共3页

通过比较在分批发酵中分别加入诱导剂IPTG0.3mM和0.5mM与诱导时间为3h和4h的不同组合,观察其对重组蛋白表达的影响,从而筛选出目的蛋白高效表达的最佳条件.实验表明,工程菌在对数生长的中后期(OD600为4)时添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导... 通过比较在分批发酵中分别加入诱导剂IPTG0.3mM和0.5mM与诱导时间为3h和4h的不同组合,观察其对重组蛋白表达的影响,从而筛选出目的蛋白高效表达的最佳条件.实验表明,工程菌在对数生长的中后期(OD600为4)时添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导对蛋白的表达最为有利. 展开更多

关键词 发酵 IPTG 诱导 目的蛋白

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LHRH介导的TAT蛋白核心肽PTD的制备及跨膜研究 被引量：2

11

作者 马洪圆 岳玉环 +7 位作者 李泽鸿 张国利 田园 吴广谋 刘雨玲 余晓颖 杨雯棋 陈云雨 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第1期8-12,175,共6页

为了研究促黄体激素释放激素(LHRH)介导的TAT蛋白核心肽PTD的跨膜作用,测定目的蛋白的转导效率,试验以pET28a—PTD—GFP质粒为模板,设计含LHRH基因序列的特异性PER引物,经PCR扩增后双酶切,并克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒并... 为了研究促黄体激素释放激素(LHRH)介导的TAT蛋白核心肽PTD的跨膜作用,测定目的蛋白的转导效率,试验以pET28a—PTD—GFP质粒为模板,设计含LHRH基因序列的特异性PER引物,经PCR扩增后双酶切,并克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒并在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,超声破碎后进行硫酸铵梯度沉淀,取上清液用Phenyl—HP疏水层析柱和Q阴离子交换层析柱纯化,将纯化后的目的蛋白加到体外培养的HeLa细胞中,观察转导情况,分析目的蛋白浓度对转导效率的影响。结果表明:PER扩增得到目的基因LHRH—PTD-GFP,并成功构建出重组质粒pET28a—LHRH—PTD-GFP,在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达出目的蛋白,经Phenyl—HP疏水层析柱和Q阴离子交换层析柱成功纯化出目的蛋白,在荧光显微镜下HeLa细胞内显现明显的绿色荧光,经分析转导效率与目的蛋白浓度之间呈正相关,回归系数为0.096 6,决定系数(R^2)为0.937 8。说明LHRH介导的TAT蛋白核心肽PTD具有很好的跨膜特性,转导效率对目的蛋白浓度具有依赖性,在一定浓度范围内随着目的蛋白浓度的增加转导效率增大。 展开更多

关键词 核心肽 转促黄体激素释放激素 目的蛋白 转导效率 绿色荧光 跨膜

原文传递

重组蓖麻毒素A链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析 被引量：1

12

作者 孙嗣梅 王利春 +1 位作者 康琳 王景林 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期47-51,共5页

用PCR方法从克隆质粒pUC19-RTA中扩增出蓖麻毒素A(RTA)链基因,序列分析正确后, 亚克隆到原核表达质粒pET-His中,构建重组表达质粒pET-HisRTA,再转化到E.coli BL21(DE3) plysS中获得表达工程菌株BL21/pET-HisRTA。该工程菌在30℃经0.4mmo... 用PCR方法从克隆质粒pUC19-RTA中扩增出蓖麻毒素A(RTA)链基因,序列分析正确后, 亚克隆到原核表达质粒pET-His中,构建重组表达质粒pET-HisRTA,再转化到E.coli BL21(DE3) plysS中获得表达工程菌株BL21/pET-HisRTA。该工程菌在30℃经0.4mmol／L IPTG诱导4h后获 得可溶性表达的目的蛋白,约占菌体总蛋白的18.45％,SDS-PAGE分析显示表达的蛋白区带与 RTA相对分子量相符,约32kDa左右。表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度约达 97.53％,并可得到约18mg/L重组RTA蛋白。Western印迹和间接ELISA结果证明,重组RTA蛋 白与抗天然蓖麻毒素多抗可发生特异性的抗原抗体反应,具有良好的抗原性,这为制备RT特异 性抗体及建立RT的检测方法奠定了基础。 展开更多

关键词 可溶性表达 蓖麻毒素 抗原性 纯化 WESTERN印迹 间接ELISA A链 原核表达质粒 重组表达质粒 E.coli 抗原抗体反应 PCR方法 相对分子量 亲和层析法 特异性抗体 pET 序列分析 工程菌株 目的蛋白 显示表达 PAGE 表达产物 检测方法

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水凝胶负载pVAX1-SpaP/P防龋DNA疫苗以4种途径产生免疫效应 被引量：1

13

作者 李虎 管晓燕 +5 位作者 李敏 董竞男 肖茜文 白国辉 王铭蔚 刘建国 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2022年第27期4340-4345,共6页

背景:防龋DNA疫苗价格低廉、安全有效,有望成为人类抵抗龋病的重要手段,因而学者在寻找一种能高效诱导抗体产生的免疫途径或保护疫苗效价的缓释系统及佐剂,成为近年研究的热点。目的:观察聚乳酸乙醇酸-聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸水凝胶负载p... 背景:防龋DNA疫苗价格低廉、安全有效,有望成为人类抵抗龋病的重要手段,因而学者在寻找一种能高效诱导抗体产生的免疫途径或保护疫苗效价的缓释系统及佐剂,成为近年研究的热点。目的:观察聚乳酸乙醇酸-聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸水凝胶负载pVAX1-SpaP/P防龋基因疫苗的免疫效应。方法:以聚乳酸乙醇酸-聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸水凝胶分别负载重组质粒pVAX1-SpaP/P与空载质粒pVAX1。随机将28只新西兰大白兔分为7组,其中4组分别为股四头肌注射、颌下腺区皮下注射、口服、鼻腔滴注负载重组质粒pVAX1-SpaP/P的水凝胶,另3组为对照组,阴性对照组1股四头肌注射负载空载质粒pVAX1的水凝胶,阴性对照组2口服负载空载质粒pVAX1的水凝胶,空白对照组股四头肌注射生理盐水,初次免疫后1周增强免疫1次,间隔2周后加强免疫第2次,共免疫3次。应用ELISA法检测免疫前后唾液与血清中IgA型抗SpaP抗体、血清中IgG型抗SpaP抗体水平;免疫结束后第3天,免疫组化SP法检测免疫部位pVAX1-SpaP/P蛋白的表达。结果与结论:①经不同途径免疫负载重组质粒pVAX1-SpaP/P的水凝胶,免疫后2周兔血清中IgG型抗SpaP抗体与IgA型抗SpaP抗体水平开始升高,IgG型抗SpaP抗体水平在第10周达到峰值,IgA型抗SpaP抗体水平在第6周达到峰值,口服组6-12周的IgG型抗SpaP抗体水平高于其他6组(P<0.05),颌下腺组4-8周的IgA型抗SpaP抗体水平高于其他6组(P<0.05);②经不同途径免疫负载重组质粒pVAX1-SpaP/P的水凝胶,免疫后1周兔唾液中IgA型抗SpaP抗体水平开始升高,第8周达到峰值,颌下腺组1-6周的抗体水平高于其他6组(P<0.05),口服组8-12周的抗体水平高于其他6组(P<0.05);免疫后第2周兔唾液中IgG型抗SpaP抗体水平开始升高,第10周达到峰值,口服组第2,3,6周的抗体水平高于其他6组(P<0.05),股四头肌组第10周的抗体水平高于其他6组(P<0.05);③经不同途径免疫� 展开更多

关键词 龋病 细胞表面抗原SpaP 基因疫苗 水凝胶 疫苗 免疫应答 变异链球菌 目的蛋白

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HER2胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的可溶性表达 被引量：1

14

作者 刘阳 孙志伟 +1 位作者 俞炜源 黄海华 《生物技术通讯》 CAS 2005年第3期252-254,共3页

采用反转录PCR和PCR方法分别克隆P185HER2n/eu胞外区基因和噬菌体M13KO7g3p-N1结构域基因,然后将二者偶联入pET-22b(+)载体中,在大肠杆菌中进行融合表达。可溶性目的蛋白表达量占细菌可溶性表达产物总量的30%左右,并通过镍亲和层析纯化... 采用反转录PCR和PCR方法分别克隆P185HER2n/eu胞外区基因和噬菌体M13KO7g3p-N1结构域基因,然后将二者偶联入pET-22b(+)载体中,在大肠杆菌中进行融合表达。可溶性目的蛋白表达量占细菌可溶性表达产物总量的30%左右,并通过镍亲和层析纯化出目的蛋白。以上结果为从噬菌体抗体库中筛选抗P185HER2/neu的抗体奠定了基础。 展开更多

关键词 大肠杆菌 胞外区 可溶性表达 基因 克隆 反转录PCR 噬菌体抗体库 目的蛋白 PCR方法 融合表达 层析纯化 表达产物 结构域 表达量 载体 细菌

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重组Trail蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化条件的优化 被引量：2

15

作者 蔡媛媛 李雪燕 +2 位作者 吴玉 杜晶春 徐霞 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期596-600,共5页

目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体胞外功能区的原核表达质粒,优化诱导蛋白表达的相关条件,检测切胶纯化所得蛋白的抗原结合活性,以及亲和层析纯化蛋白的促凋亡功能。方法:扩增Trail胞外功能区第114-281个氨基酸基因序列,插入融合表达... 目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体胞外功能区的原核表达质粒,优化诱导蛋白表达的相关条件,检测切胶纯化所得蛋白的抗原结合活性,以及亲和层析纯化蛋白的促凋亡功能。方法:扩增Trail胞外功能区第114-281个氨基酸基因序列,插入融合表达载体pET-28α(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28α(+)-Trial114-281。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组子,调整诱导前菌群的密度(A600)值,诱导时IPTG的浓度、温度及诱导时间,确定最佳诱导条件,同时比较超声、渗透冲击和IP裂解三种破碎细菌方法以及切胶回收和Ni-NTA亲和层析方法对纯化目的蛋白的影响。Western blot鉴定切胶纯化蛋白的抗原结合活性,用Ni-NTA亲和层析方法得到的蛋白作用于A549细胞,采用流式细胞术检测检测该细胞的凋亡率。结果:成功扩增了Trail胞外区基因序列,经测序证实其正确插入到表达载体pET-28α(+)中,经IPTG诱导,在37℃时呈包涵体表达,25℃时为可溶性表达,经软件分析确定A600=0.6,IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导4 h为包涵体表达的最佳条件;A600=1.0,IPTG 1.0 mmol/L,诱导4 h为可溶性目的蛋白表达的最佳诱导条件。三种破菌方法的比较,超声法获得的蛋白最多。切胶和Ni-NTA亲和柱纯化的方法都得到了目的蛋白,Westernblot分析显示,切胶纯化的蛋白有较好的抗原结合活性,亲和层析得到的可溶性蛋白可以促使A549细胞发生凋亡。结论:成功构建了重组表达载体pET28α-Trial114-281,在A600值、IPTG以及诱导时间都相同的情况下,37℃出现包涵体表达,而25℃则出现了可溶性表达。切胶纯化获得蛋白有较好的抗原结合活性,亲和层析纯化的可溶性蛋白能保持其原有的功能不被破坏,促使肿瘤细胞A549的凋亡。 展开更多

关键词 pET-28α-Trail114-281 优化条件 目的蛋白 纯化

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重组毕氏酵母表达rhs-TRAIL发酵条件的优化研究 被引量：1

16

作者 胡书良 陈惠音 +1 位作者 李茹冰 孔祥平 《现代食品科技》 EI CAS 2005年第2期12-14,共3页

为了提高重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(rhs-TRAIL,114-281)在毕氏酵母工程菌中的表达量,采用1000mL摇瓶培养体系,优化研究了在不同培养基、pH值、表达时间、甲醇浓度等培养条件下的表达情况。经条件优化,最终确定了培养... 为了提高重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(rhs-TRAIL,114-281)在毕氏酵母工程菌中的表达量,采用1000mL摇瓶培养体系,优化研究了在不同培养基、pH值、表达时间、甲醇浓度等培养条件下的表达情况。经条件优化,最终确定了培养基为完全培养基BMGY/BMMY,甲醇浓度为0.5%,pH为6.0,表达时间为96h。在此优化条件下,目的蛋白表达量可以达到68mg/L。 展开更多

关键词 毕氏酵母 rhs—TRAIL 发酵条件 目的蛋白 诱导表达

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牛朊病毒正常蛋白特异性片段的克隆表达和纯化 被引量：1

17

作者 李炎鑫 马贵平 +1 位作者 尹少满 田波 《检验检疫科学》 2005年第3期3-6,共4页

〔目的〕表达重组牛朊病毒正常蛋白特异性片段。〔方法〕用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因,利用DNA重组技术,将牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,将表达... 〔目的〕表达重组牛朊病毒正常蛋白特异性片段。〔方法〕用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因,利用DNA重组技术,将牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,将表达产物(包涵体)用8mol/L尿素溶解,在变性条件下用Cu2+氧化复性纯化。〔结果〕重组表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,目的蛋白分子量约为15KD,Westernblotting分析表明,目的蛋白具有朊病毒蛋白的抗原特性,变性条件下用Cu2+氧化复性纯化得到电泳纯的重组蛋白。〔结论〕这一工作为下一步制备抗体和进行结构、功能的研究打下扎实基础。 展开更多

关键词 特异性 片段 纯化 克隆表达 聚合酶链式反应 DNA重组技术 牛 重组表达质粒 大肠杆菌 氧化复性 Cu2+ 目的蛋白 朊病毒蛋白 表达载体 基因插入 表达产物 高效表达 抗原特性 重组蛋白 包涵体 分子量 分析表 变性 引物 电泳

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大肠杆菌表达的成骨蛋白-1的复性研究 被引量：1

18

作者 王雪 韩金祥 党立 《山东科学》 CAS 2005年第2期35-40,共6页

带有rhOP 1 pBV221 的E.coli表达得到的rhOP 1以不溶的包涵体形式存在,用高浓度的变性剂溶解后,经过DEAE FF纯化,得到高纯度的目的蛋白。利用各种不同方法对蛋白质进行复性,并对复性结果进行比较,发现添加氧化还原剂最有助于二聚体的形... 带有rhOP 1 pBV221 的E.coli表达得到的rhOP 1以不溶的包涵体形式存在,用高浓度的变性剂溶解后,经过DEAE FF纯化,得到高纯度的目的蛋白。利用各种不同方法对蛋白质进行复性,并对复性结果进行比较,发现添加氧化还原剂最有助于二聚体的形成,这是由蛋白质分子的结构和理化性质决定的。 展开更多

关键词 成骨蛋白-1 大肠杆菌表达 复性 E.COLI 氧化还原剂 蛋白质分子 目的蛋白 理化性质 变性剂 高纯度 二聚体 体形

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重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子工程菌诱导条件的优化研究 被引量：1

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作者 余琼 孙怡宁 +1 位作者 王超 邹积宏 《黑龙江医药》 CAS 2006年第6期448-450,共3页

目的：本实验用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行培养,探讨目的蛋白最高表达量的诱导条件。方法：通过实验条件的优化确定了适合GM-CSF表达的诱导温度、诱导时间和培养基等。结论：带有GM-CSF的基因工程菌在30℃生长最合适,培养... 目的：本实验用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行培养,探讨目的蛋白最高表达量的诱导条件。方法：通过实验条件的优化确定了适合GM-CSF表达的诱导温度、诱导时间和培养基等。结论：带有GM-CSF的基因工程菌在30℃生长最合适,培养5小时后42℃升温诱导5小时目的蛋白表达量最高。 展开更多

关键词 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 目的蛋白 诱导

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人层粘连蛋白α4链LG1组件融合蛋白的表达

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作者 连继勤 张玉静 +2 位作者 戴旭芳 张艳宇 何凤田 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第3期182-184,共3页

目的表达重组人层粘连蛋白α4链LG1组件(HumanLamininAlpha4LG1Module,hLNα4LG1)蛋白并检测其抗原性。方法采用RTPCR方法从人胎盘组织扩增hLNα4LG1的cDNA片段,用TA克隆法将其插入pMD18T载体进行测序。用DNA重组技术构建原核表达载体pE... 目的表达重组人层粘连蛋白α4链LG1组件(HumanLamininAlpha4LG1Module,hLNα4LG1)蛋白并检测其抗原性。方法采用RTPCR方法从人胎盘组织扩增hLNα4LG1的cDNA片段,用TA克隆法将其插入pMD18T载体进行测序。用DNA重组技术构建原核表达载体pET28aLG1,用BL21(DE3)pET系统表达hLNα4LG1融合蛋白,SDSPAGE鉴定表达产物,用NiNTA亲和柱对表达蛋白进行纯化,并进行Westernblot分析。结果已成功获得hLNα4LG1cDNA序列,与GenBank中序列同源性为100%。12%SDSPAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)pET28aLG1总蛋白中出现一条相对分子质量为26000的新蛋白带,纯化后目的蛋白纯度达90%以上,且Westernblot可特异地检测到目的蛋白所对应转移带。结论成功表达和纯化hLNα4LG1蛋白,且具有良好的抗原性,为研究LG组件在疾病发生过程中的作用及其功能位点打下了基础。 展开更多

关键词 层粘连蛋白 融合蛋白 组件 SDS-PAGE RT-PCR方法 DNA重组技术 GENBANK Western Module CDNA片段 原核表达载体 BLOT分析 cDNA序列 相对分子质量 链 目的蛋白 序列同源性 胎盘组织 表达产物 功能位点 发生过程 抗原性 重组人

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