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降低诱导温度提高毕赤酵母甲醇代谢关键酶基因转录水平和猪-α干扰素生产性能 被引量：1
1
作者 金虎 戴科科 +3 位作者 汪汇慧 李震 段作营 史仲平 《工业微生物》 CAS CSCD 2011年第6期52-57,共6页
以一株表达猪-α干扰素（pIFN-α）重组毕赤酵母为研究对象，考察了诱导温度对pIFN-α表达、细胞代谢活性及甲醇代谢关键酶的影响。在5L发酵罐开展毕赤酵母高密度流加培养生产表达pIFN-α研究，利用实时PCR技术对不同诱导温度、诱导稳... 以一株表达猪-α干扰素（pIFN-α）重组毕赤酵母为研究对象，考察了诱导温度对pIFN-α表达、细胞代谢活性及甲醇代谢关键酶的影响。在5L发酵罐开展毕赤酵母高密度流加培养生产表达pIFN-α研究，利用实时PCR技术对不同诱导温度、诱导稳定期的胞内甲醇代谢关键酶（包括解毒酶）基因转录水平进行定量分析。低温（20℃）可以同时提高细胞的代谢活性和猪-α干扰素的表达水平，低温（20℃）下最高pIFN-α抗病毒活性达到5．57×10^6IU／mL，是30℃常温诱导下最高抗病毒活性（2．9×10^5IU／mL）的19．2倍；相比于30℃常温诱导，20℃下醇氧化酶（AOX）、甲醛脱氢酶（FLD）、甲酸脱氢酶（H）H）、过氧化氢酶（CAT）及二羟基丙酮合成酶（DHAS）基因的转录水平明显提高，其中CAT和DHAS转录水平的增加尤为显著。低温诱导提高pIFN-α表达原因在于：（1）甲醇利用速度快，细胞代谢活性强；（2）低温诱导下甲醛产能途径和解毒能力得到加强，为合成细胞物质提供更多的能量；（3）甲醛同化途径关键酶（DHAS）转录水平在低温下增强更为显著，促使更多的碳流向细胞合成和外源蛋白表达。 展开更多
关键词 毕赤酵母 猪-α干扰素 甲醇代谢 诱导温度 转录
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重组猪α干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中的表达 被引量：22
2
作者 陈涛 于瑞嵩 +2 位作者 刘惠莉 李震 曹祥荣 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期339-342,共4页
用巨引物PCR法介导的定点突变把猪α干扰素 (PoIFN α)第 86位Cys(TGC)突变为Tyr(TAC) ,同时将其成熟蛋白N端第一个密码子TGT同义突变大肠杆菌偏爱的密码子TGC ,构建了大肠杆菌融合基因表达载体pGEX IFN ,表达产物占菌体总蛋白的 2 0 %... 用巨引物PCR法介导的定点突变把猪α干扰素 (PoIFN α)第 86位Cys(TGC)突变为Tyr(TAC) ,同时将其成熟蛋白N端第一个密码子TGT同义突变大肠杆菌偏爱的密码子TGC ,构建了大肠杆菌融合基因表达载体pGEX IFN ,表达产物占菌体总蛋白的 2 0 %。将以包涵体形式表达的目的蛋白经变、复性处理 ,并以FPLC进一步纯化 ,得到了具有较高生物活性的产物 (5 2 0 0IU mg)。 展开更多
关键词 重组猪α干扰素 基因定点突变 大肠杆菌 表达
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猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究 被引量：17
3
作者 杜以军 姜平 +1 位作者 李玉峰 王先炜 《中国病毒学》 CSCD 2006年第4期390-393,共4页
本研究利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-α,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-poIFN-α。该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定,为107TCID50/mL... 本研究利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-α,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-poIFN-α。该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定,为107TCID50/mL。RT-PCR检测证明目的基因在mRNA水平上可有效表达;在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性,从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。 展开更多
关键词 猪α干扰素 重组腺病毒 口蹄疫病毒
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猪α干扰素对猪圆环病毒2型亚单位疫苗免疫效果的影响 被引量：13
4
作者 曹瑞兵 周国栋 陈溥言 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期867-872,共6页
为了评估酵母表达的PCV2 Cap蛋白在猪体的免疫特性以及猪α干扰素对其的免疫佐剂效果,将酵母表达的PCV2 Cap蛋白配比适量的铝胶或重组猪α干扰素制成亚单位疫苗。30日龄仔猪分别接种铝胶佐剂亚单位疫苗和猪α干扰素佐剂亚单位疫苗,同时... 为了评估酵母表达的PCV2 Cap蛋白在猪体的免疫特性以及猪α干扰素对其的免疫佐剂效果,将酵母表达的PCV2 Cap蛋白配比适量的铝胶或重组猪α干扰素制成亚单位疫苗。30日龄仔猪分别接种铝胶佐剂亚单位疫苗和猪α干扰素佐剂亚单位疫苗,同时设攻毒对照与空白对照,首免后21 d加强免疫,二免后14 d用PCV2 JS株攻毒。铝胶佐剂亚单位疫苗免疫猪体后产生了PCV2特异性中和抗体。猪α干扰素佐剂亚单位疫苗组仔猪免疫后产生的ELISA抗体和中和抗体都显著高于铝胶亚单位疫苗组仔猪。攻毒对照组的4只仔猪攻毒后全都产生了病毒血症,并有较长时间的发热;铝胶亚单位疫苗组4头仔猪中只有1头仔猪产生病毒血症,添加猪α干扰素亚单位疫苗组的仔猪攻毒后都没有产生病毒血症。综合分析试验猪的病毒感染、临床表现和生产性能等情况表明Cap蛋白亚单位疫苗具有免疫保护效果,猪α干扰素可显著增强Cap蛋白亚单位疫苗接种仔猪的体液免疫反应,提高PCV-2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护效果。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 重组CAP蛋白 免疫特性 猪α干扰素 免疫佐剂
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猪α干扰素的原核表达及抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定 被引量：12
5
作者 闫若潜 赵雪丽 +2 位作者 赵明军 盛敏 吴志明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期570-574,共5页
为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制剂,本研究采用PCR技术自猪肝脏总DNA中扩增、克隆猪α干扰素(PoIFN-α)成熟肽基因并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪α干扰素(rPoIFN-α)蛋白通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性... 为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制剂,本研究采用PCR技术自猪肝脏总DNA中扩增、克隆猪α干扰素(PoIFN-α)成熟肽基因并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪α干扰素(rPoIFN-α)蛋白通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用细胞病变抑制法分别测定rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗水泡性口炎病毒(VSV)增殖活性及在Marc-145细胞上抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的增殖活性,以分别评价rPoIFN-α的活性单位及其体外抑制高致病性PRRSV增殖所需的最低浓度。结果表明,克隆的PoIFN-α成熟肽基因全长501bp,编码166个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子量大小20.7ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白纯度在95%以上;纯化的rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗VSV病毒活性单位为1.4482×104IU/mL(5.2×106IU/mg),在Marc-145细胞上能完全抑制高致病性PRRSV增殖所需的rPoIFN-α蛋白最低有效剂量为640U/mL(2.3×104U/mg)。这些研究结果为新型基因工程抗病毒制剂的开发以及用于高致病性PRRSV性疾病的预防和治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 猪α干扰素 表达 纯化 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 抗病毒活性
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猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定 被引量：10
6
作者 姚清侠 钱平 +3 位作者 曹毅 徐卓菲 何雁南 陈焕春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1456-1460,共5页
利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母... 利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。 展开更多
关键词 猪α-干扰素 毕赤酵母 分泌表达 抗病毒活性
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猪α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究 被引量：11
7
作者 闫若潜 吴志明 +3 位作者 张志凌 盛敏 刘光辉 赵明军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期248-255,共8页
为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleuk... 为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleukin-2,PoIL-2)成熟肽基因连接,构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因,并克隆入pGEM-T Easy载体,将PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体进行原核表达。通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中的PoIFN-α在不同细胞系上对不同病毒增殖活性的抑制作用;分别采用MTT法和PoIL-2 ELISA试验方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中PoIL-2的生物学活性。结果表明成功构建并克隆PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中得到高效表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白相对分子质量约36.7 ku,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在细胞上具有与单一rPoIFN-α蛋白相近的抑制病毒增殖活性,其中在PK-15细胞上抗VSV的活性单位为1.891×104I U.mL-1,在Marc-145细胞上抑制高致病性PRRSV增殖的活性单位为905 U.mL-1;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有与单一rPoIL-2蛋白对照相近的生物学活性,可明显促进CTLL-2细胞的增殖,并可与抗PoIL-2单抗发生特异性免疫反应。这表明rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白双重的生物学活性,为基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗等研究奠定了基础。 展开更多
关键词 猪α干扰素 猪白细胞介素2 重叠延伸PCR 嵌合基因 融合表达 活性
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重组猪α干扰素防治仔猪流行性腹泻病试验及临床应用 被引量：11
8
作者 赵永旭 袁秀芳 +2 位作者 姜平 李慧 王一成 《浙江农业科学》 2017年第2期291-293,共3页
针对近年在我国再次出现的猪流行性腹泻,尤其是造成初生仔猪大批死亡的情况,本试验应用酵母表达的重组猪α-干扰素开展初生仔猪流行性腹泻病的临床防治试验。选择了3个发病猪场,以口服重组猪α-干扰素方式进行防治。结果表明,口服重组猪... 针对近年在我国再次出现的猪流行性腹泻,尤其是造成初生仔猪大批死亡的情况,本试验应用酵母表达的重组猪α-干扰素开展初生仔猪流行性腹泻病的临床防治试验。选择了3个发病猪场,以口服重组猪α-干扰素方式进行防治。结果表明,口服重组猪α-干扰素对初生仔猪流行性腹泻具有较好的防治作用,仔猪存活率可达50%~70%。同时进行腹腔或/和口服补液,仔猪存活率从53%提升到71%。同时对重组猪α-干扰素进行临床防治应用,取得了较好的效果。 展开更多
关键词 重组猪α-干扰素 猪流行性腹泻病 仔猪存活率
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猪α干扰素的表达及在PAM细胞系中抗PRRSV活性检测 被引量：9
9
作者 万博 鲍登克 +4 位作者 乔松林 徐德 杨苏珍 王彦斌 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第3期93-95,99,共4页
为研究猪α干扰素蛋白功能和了解猪α干扰素蛋白的抗病毒活性,扩增并测序了猪α干扰素基因(IFN-α),并克隆至原核表达载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-IFN-α,将pET-IFN-α转化至BL21进行表达。Western-Blot结果表明,表达的蛋白具有... 为研究猪α干扰素蛋白功能和了解猪α干扰素蛋白的抗病毒活性,扩增并测序了猪α干扰素基因(IFN-α),并克隆至原核表达载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-IFN-α,将pET-IFN-α转化至BL21进行表达。Western-Blot结果表明,表达的蛋白具有很好的生物学活性。用细胞病变抑制法在PAM细胞系上进行抗病毒活性测定,结果表明,猪α干扰素有较为显著的抗PRRSV活性,其抗病毒活性效价约为1.13×106U/mg。 展开更多
关键词 猪α干扰素 表达 抗病毒活性 猪繁殖与呼吸综合征病毒
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重组猪α干扰素治疗高致病性猪蓝耳病的研究 被引量：7
10
作者 岑路 贺亮亮 +3 位作者 邓苏理 朱艳平 张献杰 郭霄峰 《动物医学进展》 CSCD 2008年第6期15-19,共5页
为了观察重组猪α干扰素对高致病性猪蓝耳病临床治疗效果,采用毕赤酵母表达系统高效表达的重组猪α干扰素制剂,按照农业部颁布的《高致病性猪蓝耳病防治技术规范》进行高致病性猪蓝耳病小量临床试验。结果表明,该制剂对高致病性猪蓝耳... 为了观察重组猪α干扰素对高致病性猪蓝耳病临床治疗效果,采用毕赤酵母表达系统高效表达的重组猪α干扰素制剂,按照农业部颁布的《高致病性猪蓝耳病防治技术规范》进行高致病性猪蓝耳病小量临床试验。结果表明,该制剂对高致病性猪蓝耳病的治愈率超过81%。 展开更多
关键词 重组猪α干扰素 高致病性猪蓝耳病 治疗
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重组猪α干扰素理化性状及其体外抗病毒活性研究 被引量：8
11
作者 汤仁树 赵俊 王明丽 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第8期3928-3930,3934,共4页
[目的]研究重组猪α干扰素(rPoIFN-α)半成品理化性状并对其体外抗病毒活性进行测试与鉴定。[方法]用HEp-2/VSV体系对3批rPoIFN-α蛋白进行抗病毒活性检测,以重组人IFN-α为参比品,测定干扰素效价;用0.25%胰蛋白酶HCl以及鼠抗猪α干扰... [目的]研究重组猪α干扰素(rPoIFN-α)半成品理化性状并对其体外抗病毒活性进行测试与鉴定。[方法]用HEp-2/VSV体系对3批rPoIFN-α蛋白进行抗病毒活性检测,以重组人IFN-α为参比品,测定干扰素效价;用0.25%胰蛋白酶HCl以及鼠抗猪α干扰素单克隆抗体作用已知效价的rPoIFN-α半成品,并检测各批次抗病毒活性,对rPoIFN-α理化性状进行评价;在猪肾细胞株(PK-15)上检测rPoIFN-α对猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的致细胞病变抑制效应,观察rPoIFN-α的体外抗病毒活性。[结果]HEp-2/VSV体系滴定rPoIFN-α半成品效价可达1.5×105IU/ml,比活性达1.1×106IU/mg;rPoIFN-α经0.25%胰蛋白酶37℃作用1h,效价残留率低于1%,经HCl(pH=2.0)处理72h效价残留率高达95%以上,经56℃处理30min效价残留率高于47%,经鼠抗猪α干扰素单克隆抗体37℃作用1h后效价残留率约为1%;体外抗病毒试验表明,用50和500IU/mlrPoIFN-α可分别抑制PRV和PPV对PK-15细胞株致细胞病变效应。[结论]rPoIFN-α具有IFN-α的基本理化性状,其在体外可分别抑制PRV、PPV对PK-15细胞株致细胞病变效应,但剂量有差别。 展开更多
关键词 猪α干扰素 理化性状 抗病毒活性
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猪α-干扰素临床促仔猪生长及疾病预防试验 被引量：9
12
作者 岑路 岑伟建 +1 位作者 刘键强 卢和丰 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第2期141-143,共3页
选择广东四会某猪场40只断奶仔猪为观察对象,开展重组猪α-干扰素在促进生长作用和预防病毒性疾病方面的临床试验。试验1、2组与对照组相比较料重比分别降低6.3%和17.23%,平均每日增重率分别改变了-3.69%和24.85%,成活率分别提高了6.6%... 选择广东四会某猪场40只断奶仔猪为观察对象,开展重组猪α-干扰素在促进生长作用和预防病毒性疾病方面的临床试验。试验1、2组与对照组相比较料重比分别降低6.3%和17.23%,平均每日增重率分别改变了-3.69%和24.85%,成活率分别提高了6.6%和14.3%,腹泻率分别降低了11.5%和26.9%,疾病总防治率分别提高了40.1%和55.49%;试验观察期间,对照组诊断为蓝耳病的4例,死亡1例,试验组则没有发生蓝耳病例。表明猪α-干扰素对仔猪的生长有良好的促进作用,具有显著的紧急预防病毒性疾病效果。 展开更多
关键词 重组猪α-干扰素 断奶仔猪 促生长 预防疾病
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重组猪干扰素α的纯化工艺研究 被引量：7
13
作者 苏世云 夏俊保 +2 位作者 赵俊 吴琼 王明丽 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第14期7363-7365,共3页
[目的]研究重组猪干扰素α的纯化工艺,为进一步研究该蛋白的分子结构及rPoIFN-α标准品的制备奠定基础。[方法]将含重组菌E.coliBL21诱导表达后得到的粗制rPoIFN-α,分别用2种方案进行纯化。方案1,依次用GST亲和层析法、DEAE阴离子交换... [目的]研究重组猪干扰素α的纯化工艺,为进一步研究该蛋白的分子结构及rPoIFN-α标准品的制备奠定基础。[方法]将含重组菌E.coliBL21诱导表达后得到的粗制rPoIFN-α,分别用2种方案进行纯化。方案1,依次用GST亲和层析法、DEAE阴离子交换法及分子筛法层析三步法进行纯化;方案2,依次用GST亲和层析和分子筛法层析两步法进行纯化。纯化结果用SDS-PAGE及Western-blot进行纯度检测及鉴定。[结果]诱导表达后的表达产物经SDS-PAGE检测,发现在45Kd分子量处有目的条带,Western-blot检测有特异性条带。通过两步法纯化后的rPoIFN-α纯度达96%,蛋白得率为42.8%,三步纯化纯度为98.8%。[结论]两步法得到的蛋白纯度非常接近三步法,但与三步法相比工艺更为简单方便。 展开更多
关键词 重组蛋白 猪α干扰素 层析
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猪α干扰素原核表达载体的构建及表达 被引量：6
14
作者 刘占通 崔保安 +4 位作者 舒畅 金喜新 陈红英 杨明凡 魏战勇 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期398-401,共4页
以重组克隆质粒pGEM-T-IFN-αZ为模板,PCR扩增杂种猪α干扰素,将其插入原核表达载体pET-43.1a-c(+)中,构建了猪α干扰素原核表达载体pET-IFN-α,实现了猪α干扰素在大肠杆菌BL21中的表达.SDS-PAGE电泳、Western-blotting检测均出现了特... 以重组克隆质粒pGEM-T-IFN-αZ为模板,PCR扩增杂种猪α干扰素,将其插入原核表达载体pET-43.1a-c(+)中,构建了猪α干扰素原核表达载体pET-IFN-α,实现了猪α干扰素在大肠杆菌BL21中的表达.SDS-PAGE电泳、Western-blotting检测均出现了特异性的条带.SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白以可溶性形式存在.经薄层扫描分析,表达产物约占菌体总蛋白的29.8%. 展开更多
关键词 猪α干扰素 原核表达 Western—blotting
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猪α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测 被引量：6
15
作者 崔保安 陈红英 +3 位作者 张素梅 刘占通 金喜新 宋凌云 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2008年第4期42-46,共5页
【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中... 【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-IFN-α,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。【结果】SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为45 ku的GST-IFN-α,Westernblot证实GST-IFN-α能与猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应。重组猪α干扰素经谷胱苷肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为2.24×103U/mg。【结论】建立的表达系统能够表达重组猪α干扰素,表达的重组猪α干扰素具有一定的生物活性。 展开更多
关键词 猪α干扰素 原核表达 抗病毒活性
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多变量在线测量条件下的猪α干扰素高效表达 被引量：5
16
作者 金虎 高敏杰 +4 位作者 徐俊 段作营 刘立明 李震 史仲平 《过程工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期563-567,共5页
在5L发酵罐中进行了重组毕赤酵母高密度培养表达猪α干扰素（IFN-α）的研究.在诱导阶段，高且稳定的摄氧速度（OUR）是实现毕赤酵母流加培养高效表达IFN-α的最关键因素，利用多变量在线测量可有效地帮助寻找高且稳定的OUR的形成条件.... 在5L发酵罐中进行了重组毕赤酵母高密度培养表达猪α干扰素（IFN-α）的研究.在诱导阶段，高且稳定的摄氧速度（OUR）是实现毕赤酵母流加培养高效表达IFN-α的最关键因素，利用多变量在线测量可有效地帮助寻找高且稳定的OUR的形成条件.结果表明，高且稳定的OUR[约200-280mmol/（L·h）]可通过适度控制混加期及诱导期的菌体比增殖速度和甲醇浓度（约10g/L）而得以实现.在此条件下，猪α干扰素最高活性可达6.6×10^6IU/mL，是较低OUR的罐发酵及摇瓶条件下的10-300倍. 展开更多
关键词 毕赤酵母 表达 流加培养 摄氧速率 猪α干扰素
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双抗体夹心ELISA法测定猪α-干扰素的浓度 被引量：6
17
作者 蒋佳颖 王一成 +3 位作者 杨孝朴 袁秀芳 李军星 徐丽华 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第5期740-745,共6页
为了能够准确测定猪血清中猪α-干扰素（Po IFN-α）含量及猪α-干扰素制品的浓度,本研究以制备并经过亲和层析提纯的兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆抗体为包被抗体,以制备的鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作为二抗,建立了测定猪α-干扰素... 为了能够准确测定猪血清中猪α-干扰素（Po IFN-α）含量及猪α-干扰素制品的浓度,本研究以制备并经过亲和层析提纯的兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆抗体为包被抗体,以制备的鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作为二抗,建立了测定猪α-干扰素浓度的双抗体夹心ELISA法（DAS-ELISA）。通过条件优化,最佳兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆纯化抗体包被浓度为12.5μg·m L^-1,最佳鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作用浓度为6.25μg·m L^-1,利用本实验室制备的已知浓度猪α-干扰素标准蛋白建立标准曲线,确定该方法检测猪α-干扰素浓度范围为0.0781-2.50μg·m L^-1。与Lowry法、冻干称量法测定猪α-干扰素浓度相比较,3种方法检测结果无显著差异,但所建立的双抗体夹心ELISA法能够检测血清中猪α-干扰素浓度,且方法简便。 展开更多
关键词 猪α-干扰素 双抗体夹心ELISA 定量检测
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重组猪α干扰素冻干保护剂的筛选 被引量：6
18
作者 董世娟 朱于敏 +2 位作者 于瑞嵩 沈世缘 李震 《中国兽药杂志》 2010年第3期37-40,共4页
为使重组猪α干扰素(rPoIFN-α)制品更好地应用于生产实践中,采用保守的冻干工艺重点对rPoIFN-α制品的冻干保护剂进行筛选,通过外观检测、水分含量、活性检测对14种冻干保护剂进行了比较和筛选。研究结果表明,终浓度2%、4%和5%的甘露... 为使重组猪α干扰素(rPoIFN-α)制品更好地应用于生产实践中,采用保守的冻干工艺重点对rPoIFN-α制品的冻干保护剂进行筛选,通过外观检测、水分含量、活性检测对14种冻干保护剂进行了比较和筛选。研究结果表明,终浓度2%、4%和5%的甘露醇的保护效果较好,活性保持率分别为102.8%、95.1%、108.3%。按照活性好的这三个配方再冻干三批制品进行放置40℃加速稳定性实验。结果表明,在40℃放置三个月后,三个保护剂制品效价基本没变化,稳定性良好,有效期暂定为两年。本研究初步探索了rPoIFN-α的冻干配方,为rPoIFN-α的产业化打下了基础。 展开更多
关键词 重组猪α干扰素 冻干保护剂 筛选
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猪α干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化 被引量：6
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作者 张存 叶伟成 +3 位作者 王一成 袁秀芳 刘蔓雯 张燕 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第1期6-9,共4页
为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素(PoIFNα)在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/P... 为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素(PoIFNα)在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/PoIFNα以限制性内切酶SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115菌株,经抗性筛选获得4拷贝PoIFNα基因的重组菌株GS115/PoIFNα;重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白,表达量达136mg/L。表达产物经过SP-Sepharose阳离子交换层析,可以得到纯度较高的rPoIFNα,纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108U/mg。 展开更多
关键词 猪α干扰素 毕赤酵母 分泌表达
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甲醇/山梨醇共混流加诱导改变毕赤酵母生产猪α干扰素过程的代谢产能途径强化发酵性能 被引量：4
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作者 汪汇慧 金虎 +5 位作者 高敏杰 戴科科 董世娟 于瑞嵩 李震 史仲平 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期164-177,共14页
旨在探讨毕赤酵母生产猪α干扰素过程的代谢产能规律及其对发酵性能的影响。在10 L罐下,开展了不同诱导条件下的毕赤酵母高效发酵生产猪α干扰素过程的代谢酶学和能量再生分析研究。结果表明:甲醇单独诱导条件下、将诱导温度从30℃降低... 旨在探讨毕赤酵母生产猪α干扰素过程的代谢产能规律及其对发酵性能的影响。在10 L罐下,开展了不同诱导条件下的毕赤酵母高效发酵生产猪α干扰素过程的代谢酶学和能量再生分析研究。结果表明:甲醇单独诱导条件下、将诱导温度从30℃降低到20℃,胞内醇氧化酶(AOX)、甲醛脱氢酶(FLD)和甲酸脱氢酶(FDH)的比活性增加显著,细胞的甲醇代谢和甲醛异化产能能力、猪α干扰素抗病毒活性大幅提高,最高抗病毒活性达到1.4×106IU/mL,约为30℃诱导条件下的10倍。30℃、甲醇/山梨醇共混流加下,主要供能途径由甲醇单独诱导时的甲醛异化代谢转向TCA循环,甲醛异化供能途径被弱化、毒副产物甲醛的生成积累得到抑制,走向目标蛋白合成途径的甲醇分配比例得到提高。此时,最高抗病毒活性达到1.8×107IU/mL,是30℃甲醇单独诱导下最高活性的100倍以上。更加重要的是,共混流加诱导可以在常温、使用空气供氧的条件下进行,发酵成本明显下降、整体发酵性能改善显著。 展开更多
关键词 毕赤酵母 代谢分析 甲醇 山梨醇 温度 诱导 猪α干扰素
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