猪急性腹泻综合征冠状病毒RT-LAMP快速检测方法的建立与应用 被引量：8

1

作者 韩郁茹 石达 +5 位作者 张记宇 时洪艳 陈建飞 张鑫 刘建波 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期35-39,共5页

为建立简捷、灵敏的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)检测方法,本研究针对SADS-CoV N基因片段保守区域设计特异性的反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,经条件优化后显示建立的SADS-CoV RTLAMP检测方法最佳反应条件为64℃,50 min,初... 为建立简捷、灵敏的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)检测方法,本研究针对SADS-CoV N基因片段保守区域设计特异性的反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,经条件优化后显示建立的SADS-CoV RTLAMP检测方法最佳反应条件为64℃,50 min,初步建立SADS-CoV的RT-LAMP快速检测方法。利用该方法检测SADS-CoV、猪流行性腹泻性病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪肠道病毒9型(PEV9),评估其特异性,结果显示除SADS-CoV外,该方法与其它病原无交叉反应,特异性较强;将病毒RNA 10倍倍比稀释后作为模板,利用该RT-LAMP与普通RT-PCR同时检测,结果显示,RTLAMP方法比普通RT-PCR方法的敏感性高103倍,敏感性较高。以同一批次或不同批次的SADS-CoV核酸为模板进行RT-LAMP试验,结果显示RT-LAMP批内批间均可稳定的检出阳性样本,表明该方法具有良好的重复性和稳定性。对经口服感染SADS-CoV和未感染仔猪的临床样本进行检测,结果显示RT-LAMP与普通RT-PCR检测结果高度一致。本实验首次建立的SADS-CoV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高,操作简便、快速和高通量检测的优点,为临床SADS-CoV感染的快速诊断和综合防控提供检测手段。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征病毒 N基因 反转录-环介导恒温扩增技术 快速检测

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猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：7

2

作者 张记宇 韩郁茹 +9 位作者 时洪艳 陈建飞 张鑫 刘建波 张燎原 冯书风 冯廷帅 季朝阳 石达 冯力 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期2887-2894,共8页

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品... 为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10^(1)~3.31×10^(7)拷贝·μL^(-1)模板量时,呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10^(1)拷贝·μL^(-1),组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^(6.7)、10^(5.3)拷贝·mL^(-1)。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征病毒 N基因 荧光定量PCR 检测

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猪急性腹泻综合征病毒RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：6

3

作者 司广斌 陈志飞 +2 位作者 梁文清 陈一波 贺东生 《中国动物检疫》 CAS 2020年第11期76-81,共6页

为建立一种鉴定猪急性腹泻综合征病毒(SADS-CoV)的RT-PCR方法,根据NCBI登录的SADS-CoV N基因保守区域序列,设计了3对引物(P1、P2和P3),通过对SADS-CoV及其他6种病毒进行检测,筛选出最合适的引物,然后对退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、r... 为建立一种鉴定猪急性腹泻综合征病毒(SADS-CoV)的RT-PCR方法,根据NCBI登录的SADS-CoV N基因保守区域序列,设计了3对引物(P1、P2和P3),通过对SADS-CoV及其他6种病毒进行检测,筛选出最合适的引物,然后对退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、rTaq DNA聚合酶浓度和循环次数等反应条件进行了优化。结果显示,P3引物对SADS-CoV特异性最好,与其他病毒无交叉反应。敏感性试验显示,该方法最低检测限可达9.55×10~2 copies/μL;重复性试验显示该方法重复性良好。运用建立的RT-PCR方法,对广东省的21份临床样品进行检测,结果检出SADS-CoV阳性样品4份,阳性样品的测序结果与其RT-PCR完全一致。结果表明,本研究成功建立了一种鉴定SADS-CoV的RT-PCR方法,且该方法具有检测快速、成本廉价、特异性强、敏感性高和重复性好的优点,可以用于SADS-CoV的临床诊断。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征病毒 N基因 RT-PCR 诊断

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猪急性腹泻综合征病毒N基因多克隆抗体的制备及其生物信息学分析 被引量：1

4

作者 于子萍 兰添 +9 位作者 陈伟月 张华韵 于宁 吕荞 施瑶凯 刘宇梦 李程凯 鲁会军 孙文超 金宁一 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第8期873-879,共7页

目的制备SADS-CoV N蛋白的多克隆抗体,进一步了解及探究SADS-CoV N蛋白的基本结构,为猪急性腹泻综合征病毒疫苗的研制奠定基础。方法将N蛋白基因片段克隆至pColdⅡ载体,并将其转化至BL21感受态细胞,采用1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,经Ni-... 目的制备SADS-CoV N蛋白的多克隆抗体,进一步了解及探究SADS-CoV N蛋白的基本结构,为猪急性腹泻综合征病毒疫苗的研制奠定基础。方法将N蛋白基因片段克隆至pColdⅡ载体,并将其转化至BL21感受态细胞,采用1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,经Ni-NTA柱纯化后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用生物信息学软件对SADS-CoV N蛋白的理化性质、亲疏水性、信号肽、二级结构、三级结构及B淋巴细胞与T淋巴细胞抗原表位进行预测。结果重组菌在37℃经1mmol/L IPTG诱导表达分子质量为48 ku的目的蛋白,与预期N蛋白分子质量相符。用该蛋白免疫小鼠,制备的抗N蛋白多克隆抗体的效价可达1︰200000;经IFA、Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能够特异性识别SADS-CoV感染猴肾细胞(Vero)表达的N蛋白,具有较高的抗体效价及特异性。生物信息学分析SADS-CoV N由375个氨基酸组成,分子质量为41.636 ku,等电点为9.90;N蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,无跨膜结构;螺旋和无规则卷曲是N蛋白二级结构中主要的蛋白质元件;N蛋白存在9个潜在的B细胞表位,第127-135位、134-142位、275-283位可能存在T细胞表位。结论成功构建pColdⅡ-SADS-CoV-N重组质粒,用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获得高效的特异抗体血清。生物信息学预测SADS-CoV N含有丰富的螺旋和无规则卷曲结构,以及B、T淋巴细胞抗原表位,为揭示SADS-CoV N蛋白的功能及SADS-CoV相关的转录机制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征病毒 N蛋白 生物信息学 原核表达 多克隆抗体

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猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：8

5

作者 刘影 闫若潜 +5 位作者 杨海波 王淑娟 赵雪丽 谢彩华 柴茂 王东方 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期1189-1195,共7页

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)的多重荧光定量RT-PCR方法,本研究针对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的M基因、M基因、N基因序列保守区分别设计特异性引物/探针,经各反应条件优化... 为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)的多重荧光定量RT-PCR方法,本研究针对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的M基因、M基因、N基因序列保守区分别设计特异性引物/探针,经各反应条件优化后,建立了检测PEDV、PDCoV、SADS-CoV的多重荧光定量RT-PCR方法。特异性试验结果显示,该方法仅对PEDV、PDCoV、SADS-CoV检测为阳性,对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等的核酸检测均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法对PEDV、PDCoV、SADS-CoV重组质粒标准品的检测下限均为1.0×10^(1)拷贝/μL,且在10^(1)拷贝/μL~10^(6)拷贝/μL范围内各重组质粒均与各自的Ct值有良好的线性关系。重复性试验结果显示,批内、批间重复性试验的变异系数均在0.33%~2.53%,重复性和稳定性均较好。利用建立的多重荧光定量RT-PCR方法对采自河南各地的100份临床样品进行检测,并与3种病毒的单一RT-PCR检测方法、相应病毒的标准检测方法(由于SADS-CoV无标准检测方法,则采用RT-PCR扩增后测序并经NCBI BLAST比较分析测序结果)进行比较分析,以评估本实验建立检测方法的临床应用效果。多重荧光定量RT-PCR结果显示,PEDV、PDCoV、SADS-CoV的阳性率分别为38%(38/100)、14%(14/100)、5%(5/100),不存在混合感染现象,与PEDV、PDCoV标准检测方法的符合率为100%,且敏感性高于单一RT-PCR方法。本研究首次建立了一种特异、敏感、快速的多重荧光定量RT-PCR方法,可以用于PEDV、PDCoV、SADS-CoV的鉴别检测,为猪腹泻类疫病鉴别诊断及防控奠定基础。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 猪δ冠状病毒 猪急性腹泻综合征冠状病毒 荧光定量RT-PCR 检测方法

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猪新发冠状病毒研究进展 被引量：8

6

作者 李任峰 卢晓辉 +1 位作者 姜金庆 王自良 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期2359-2366,共8页

当前,由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情正在全球暴发大流行,这也引发业界对于动物源性冠状病毒的高度关注。猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是近年来新发现的猪冠状病毒,... 当前,由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情正在全球暴发大流行,这也引发业界对于动物源性冠状病毒的高度关注。猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是近年来新发现的猪冠状病毒,不但严重危害到养猪业,对公共卫生安全也具有潜在威胁风险。本文结合国内外现有文献,从PDCoV和SADS-CoV的病原学、病毒起源与进化、致病性以及检测诊断技术等方面进行综述,并提出展望,以拓展对SARS-CoV-2的认识,并为PDCoV和SADS-CoV的后续研究提供参考借鉴。 展开更多

关键词 猪新发冠状病毒 猪德尔塔冠状病毒 猪急性腹泻综合征冠状病毒

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猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用 被引量：4

7

作者 刘大凯 韩郁茹 +8 位作者 张记宇 张燎原 冯廷帅 杨小曼 曾苗苗 时洪艳 秦毅斌 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期499-504,共6页

为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和... 为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性。结果显示,r S1-CTD以包涵体的形式表达,在40 ku处出现特异性条带。诱导表达后的r S1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心,SDS-PAGE检测后切胶纯化,得到纯化的重组蛋白。利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33μg/m L。将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔,并在3免一周后采血,分离血清获得S1-CTD蛋白PAb。将SADS-Co V感染Vero E6细胞24 h后,以获得的兔PAb为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性。Western blot结果显示,在约250 ku处出现特异性条带,而阴性对照组无该条带;IFA结果显示,SADS-Co V感染的细胞中出现绿色荧光,而阴性对照细胞无绿色荧光。将SADS-Co V感染仔猪的回肠组织制备病理切片,以制备的PAb为一抗,通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-Co V的抗原。结果显示,该组织切片中出现棕色阳性信号,而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号。表明该PAb可与感染SADS-Co V的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应。综上所述,本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性,可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-Co V的感染,为后续SADS-Co V检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 S蛋白 原核表达 多克隆抗体 初步应用

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猪急性腹泻综合征冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：8

8

作者 周芝海 谭耀荣 +3 位作者 郑瑶瑶 曾繁文 麦凯杰 马静云 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1179-1186,共8页

为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)核衣壳(N)蛋白多克隆抗体,采用PCR方法扩增SADS-CoV/CN/GDGL/2017毒株N基因片段,并对N基因的序列以及N蛋白氨基酸突变位点进行分析。随后,将N基因片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)构建重组... 为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)核衣壳(N)蛋白多克隆抗体,采用PCR方法扩增SADS-CoV/CN/GDGL/2017毒株N基因片段,并对N基因的序列以及N蛋白氨基酸突变位点进行分析。随后,将N基因片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)构建重组质粒,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化N蛋白,通过免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。结果表明,扩增的N基因片段和所构建的重组质粒正确无误,成功诱导表达出可溶性重组蛋白SADS-CoV-N,分子质量约为67 ku,最佳诱导时间为6 h。Western-blot以及间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体能特异性检测SADS-CoV,证明重组蛋白有良好的免疫原性。本研究为后续建立SADS-CoV快速诊断方法及该病毒致病机制的深入研究奠定基础。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 N蛋白 原核表达 多克隆抗体

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2018年江西及福建省新现猪急性腹泻冠状病毒的分子流行病学调查 被引量：7

9

作者 张誉瀚 袁为锋 +4 位作者 张帆帆 李凯 李指全 宋德平 唐玉新 《养猪》 2019年第4期113-117,共5页

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV)是2017年在我国广东首次发现的一种可导致新生仔猪急性水样腹泻及死亡的新型冠状病毒。为调查2018年江西及福建猪群中该病毒的感染情况,试验建立了一种SA... 猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV)是2017年在我国广东首次发现的一种可导致新生仔猪急性水样腹泻及死亡的新型冠状病毒。为调查2018年江西及福建猪群中该病毒的感染情况,试验建立了一种SADS-CoV套式RT-PCR检测方法,并调查2018年江西及福建腹泻猪只样本中SADS-CoV的流行情况。根据GenBank数据库中SADS-CoV GDS04毒株(登录号MF167434)的核衣壳蛋白(N)基因核酸序列,设计了两对特异性套式引物。以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒等病毒的基因组为模板检测引物的特异性。通过优化反应条件建立了检测SADS-CoV的套式PCR方法,用建立的套式PCR方法对2018年从江西和福建两省8个猪场采集的492份腹泻样品进行检测。应用设计的两对套式引物扩增出了650 bp和291 bp两个特异性片段。试验建立的套式PCR检测方法特异性好,只能扩增SADS-CoV,其最低检测限度为102拷贝/μL。利用所建立的方法对来自江西和福建省的492份腹泻猪临床样品进行检测,从福建猪群样品中检出了2份SADS-CoV感染,未从江西临床样品中检出SADS-CoV。试验将为SADS-CoV的临床检测提供一种套式PCR检测方法,结果表明该病毒在福建猪群而未在江西腹泻猪群中流行,将对SADS-CoV的临床诊断等具有应用价值。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 套式PCR 腹泻 分子流行病学

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猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究 被引量：3

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作者 曾苗苗 刘大凯 +8 位作者 张记宇 张燎原 冯廷帅 杨小曼 时洪艳 张鑫 陈建飞 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期61-69,共9页

为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证... 为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin处理Vero E6细胞后以SADS-CoV感染,于感染后不同时间收获细胞,通过western blot和病毒滴度(TCID_(50))测定检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与仅感染病毒的对照组相比,采用3-MA处理Vero E6细胞后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)均显著降低(P<0.05),而采用Rapamycin处理后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)则均显著升高(P<0.05)。针对ATG5基因设计3条特异性的ATG5 si RNA(siATG5-1/2/3),将干扰效率较好的siATG5-1转染Vero E6细胞后再以SADS-CoV感染,24 h后检测病毒滴度并利用western blot检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与未转染siATG5的3组阴性细胞相比,转染细胞中SADS-CoV N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著降低(P<0.05)。本研究首次表明SADS-CoV感染可以诱导宿主细胞自噬并促进病毒的复制,该结果为深入研究SADS-CoV感染与其致病机理以及� 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 自噬 病毒复制 LC3-Ⅱ

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蝙蝠相关的冠状病毒 被引量：5

11

作者 丁翠玲 赵平 戚中田 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期935-940,共6页

2019年12月,新型冠状病毒肺炎(COVID-19)暴发,继2003年严重急性呼吸综合征(SARS)暴发后又给人类敲响了一记警钟。研究者通过溯源分析,发现COVID-19病原体严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的自然宿主可能是中华菊头蝠。21世纪以... 2019年12月,新型冠状病毒肺炎(COVID-19)暴发,继2003年严重急性呼吸综合征(SARS)暴发后又给人类敲响了一记警钟。研究者通过溯源分析,发现COVID-19病原体严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的自然宿主可能是中华菊头蝠。21世纪以来,全球共出现4次冠状病毒[严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、SARS-CoV-2]的暴发,给人类健康、公共卫生、经济发展及社会稳定造成了巨大的威胁与损失。大量证据表明,这4种冠状病毒的自然宿主可能均为蝙蝠。本文对蝙蝠相关冠状病毒的种类、全球地理分布及引起暴发的蝙蝠相关冠状病毒作一综述。 展开更多

关键词 冠状病毒 蝙蝠 严重急性呼吸综合征冠状病毒 中东呼吸综合征冠状病毒 猪急性腹泻综合征冠状病毒 严重急性呼吸综合征冠状病毒2

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猪冠状病毒的起源与遗传演化 被引量：5

12

作者 吴梓琦 吴少佳 +1 位作者 吕华达 罗永文 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期376-383,共8页

冠状病毒变异率高,宿主广泛,主要感染哺乳动物和禽类,严重威胁公共卫生安全与养殖业发展。生猪养殖业中,冠状病毒也是危害猪只健康的重要病原。本研究对4种代表性猪冠状病毒:猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, T... 冠状病毒变异率高,宿主广泛,主要感染哺乳动物和禽类,严重威胁公共卫生安全与养殖业发展。生猪养殖业中,冠状病毒也是危害猪只健康的重要病原。本研究对4种代表性猪冠状病毒:猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus, SADS-CoV)和猪δ冠状病毒(porcine delta coronavirus, PDCoV)的起源、流行、遗传演化和跨宿主传播等方面进行综述,为动物冠状病毒的传播、变异和防控研究提供借鉴。 展开更多

关键词 冠状病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪流行性腹泻病毒 猪急性腹泻综合征冠状病毒 猪δ冠状病毒 起源 遗传演化

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猪急性腹泻综合征冠状病毒检测方法研究进展

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作者 司广斌 刘福滨 《中国动物检疫》 CAS 2024年第6期75-81,共7页

猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是一种来源于菊头蝠的新型猪冠状病毒,2017年初首次发现于我国广东省腹泻仔猪,并已在广东省出现两次大流行,不仅给养猪业带来了挑战,同时也带来了潜在的公共卫生安全问题。鉴于目前尚无有效的药物和... 猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是一种来源于菊头蝠的新型猪冠状病毒,2017年初首次发现于我国广东省腹泻仔猪,并已在广东省出现两次大流行,不仅给养猪业带来了挑战,同时也带来了潜在的公共卫生安全问题。鉴于目前尚无有效的药物和疫苗,为实施高效监测以控制SADS-CoV流行,便于相关部门选择适宜的检测方法,就病毒分离鉴定、RT-PCR、巢式RT-PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)、微滴式数字PCR(ddPCR)、逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)、基因组测序技术(NGS)、免疫荧光测定(IFA)、萤光素酶免疫沉淀系统(LIPS)、免疫组织化学(IHC)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等SADS-CoV检测方法的研究进展予以综述。分析认为:各种检测方法都有其自身的优缺点以及适用场景,单一方法往往不能满足目前临床检测的需求,需要将不同的检测方法结合使用,通过优势互补,来实现对病毒的快速精确检测,并使检测方法更加简单、高效和低成本;实现病毒检测简化操作、快速和同时检测多种病毒的方法,将成为今后主要研究方向。随着检测技术的不断完善和创新,相信将会有更多的新型检测方法用于SADS-CoV检测。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 分离鉴定 分子生物学检测 血清学检测

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猪急性腹泻综合征冠状病毒S1蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

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作者 杨小曼 时洪艳 +8 位作者 张燎原 张鑫 张记宇 刘大凯 冯廷帅 曾苗苗 陈建飞 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期608-613,共6页

为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法,本研究通过构建重组真核分泌型表达质粒p CAGGS-S1-His并转染HEK293F悬浮细胞进行可溶性表达S1蛋白。转染重组质粒5 d后的细胞上清利用HisTrapTMExcel亲和层析... 为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法,本研究通过构建重组真核分泌型表达质粒p CAGGS-S1-His并转染HEK293F悬浮细胞进行可溶性表达S1蛋白。转染重组质粒5 d后的细胞上清利用HisTrapTMExcel亲和层析柱纯化,浓缩后的蛋白经SDS-PAGE、western blot鉴定显示获得了分子量约为130 ku且大于理论大小的重组S1蛋白,表明该蛋白为分泌表达且具有良好的翻译后修饰。利用获得的重组S1蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,初步建立了SADS-CoV S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法。该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清均无交叉反应,仅与SADS-CoV阳性血清反应,表明该方法特异性较强;该方法检测SADS-CoV阳性血清,当稀释至1:3 200时仍为阳性,表明该方法具有较高的敏感性;对4份阳性血清的批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性和稳定性;利用该方法和间接免疫荧光试验(IFA)对50份临床样品检测,结果显示该间接ELISA检测到9份阳性样品,41份阴性样品;IFA检出5份阳性样品,45份阴性样品,二者的总符合率为92%。综上表明,本研究建立的间接ELISA检测方法能够特异、灵敏地检测SADS-CoV S1蛋白抗体,可以用于SADS-CoV灭活疫苗的免疫效果评价以及该病原的血清学流行病学调查和免疫水平监测,为SADS-CoV所致疫病的鉴别诊断和防控奠定基础。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 S1蛋白 间接ELISA方法 抗体检测

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猪腹泻相关的冠状病毒检测方法研究进展 被引量：2

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作者 向萌 陈弟诗 +1 位作者 任玉鹏 王一丹 《养猪》 2021年第1期109-112,共4页

猪冠状病毒是猪病毒性腹泻的一类重要病原,感染仔猪死亡率可达100%,给养猪业带来了巨大的经济损失。文章将对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒以及猪急性腹泻综合征冠状病毒等4种猪冠状病毒检测方法研究现状进... 猪冠状病毒是猪病毒性腹泻的一类重要病原,感染仔猪死亡率可达100%,给养猪业带来了巨大的经济损失。文章将对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒以及猪急性腹泻综合征冠状病毒等4种猪冠状病毒检测方法研究现状进行总结,对各种方法的优缺点和应用前景进行系统的讨论和展望,以期为临床上猪冠状病毒的高效检测、精准防控,以及未来猪冠状病毒新型检测方法的研究提供新思路。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪德尔塔冠状病毒 猪急性腹泻综合征冠状病毒 检测方法

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PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量：2

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作者 陈见兴 王豪杰 +8 位作者 潘喻 刘弘毅 林欢 朱良全 陈洪岩 谢金鑫 夏长友 张贺 王玉娥 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期5439-5448,共10页

【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染... 【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域序列设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量;以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内试验验证其重复性;经检测临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。【结果】建立的三重RT-PCR检测方法最佳退火温度为58.3℃,引物最佳浓度分别为0.50、0.25和0.25μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10 copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内试验检测结果均一致。最后经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为4.4%、0%和0.73%,与已报道的检测方法一致。【结论】建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。 展开更多

关键词 猪丁型冠状病毒 新型猪急性腹泻综合征冠状病毒 塞内卡病毒A型 三重RT-PCR

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SADS-CoV S1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：2

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作者 张睿玉 李龙驹 +2 位作者 李程 周玲 马静云 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期229-233,共5页

猪急性腹泻综合征(SADS)是由猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)引起的仔猪急性腹泻、呕吐、脱水、体质量骤降,最终导致死亡的一类急性传染病。为制备SADS-CoV刺突蛋白(S1)的多克隆抗体,通过PCR扩增得到SADS-CoV S1基因片段,并将其克... 猪急性腹泻综合征(SADS)是由猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)引起的仔猪急性腹泻、呕吐、脱水、体质量骤降,最终导致死亡的一类急性传染病。为制备SADS-CoV刺突蛋白(S1)的多克隆抗体,通过PCR扩增得到SADS-CoV S1基因片段,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建出重组质粒pGEX-6p-1-S1。测序结果正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,经GST标签凝胶纯化。纯化的S1蛋白与弗氏佐剂混合后经3次皮下注射免疫BALB/c小鼠后收集血清,通过免疫印迹试验(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)进行检测。结果表明,重组的S1蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,制备的鼠抗S1蛋白多克隆抗体也具备良好的反应活性和特异性,为后续SADS-CoV血清学诊断方法的建立及S1蛋白生物学功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 S1蛋白 原核表达 多克隆抗体

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猪急性腹泻综合征冠状病毒微滴数字PCR技术的建立和应用 被引量：2

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作者 陈可欣 曾若雪 +6 位作者 裘慧 金晨晨 陈小金 董志珍 宋厚辉 张晓峰 帅江冰 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1385-1394,共10页

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)是近年来在我国新发现的一种会引起猪严重腹泻的冠状病毒,本文旨在建立一种特异性强、重复性好、灵敏度高的SADS-CoV微滴式数字聚合酶链式反应(Digital d... 猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)是近年来在我国新发现的一种会引起猪严重腹泻的冠状病毒,本文旨在建立一种特异性强、重复性好、灵敏度高的SADS-CoV微滴式数字聚合酶链式反应(Digital droplet PCR,ddPCR)检测方法。采用SADS-CoV的N基因作为本研究的靶基因,根据其基因序列设计特异性引物及探针。通过优化反应体系中的反应条件,分析方法特异性、敏感性和稳定性,并对临床样本和猪源产制品进行检测验证,建立了猪急性腹泻综合征冠状病毒微滴数字PCR体系。本方法确定最佳引物浓度为500 nmol/L,最佳探针浓度为250 nmol/L,且在58℃反应条件下,ddPCR检测结果最优。本方法与其他常见猪源性病毒无交叉反应,特异性强;本方法重复性好,批间与批内变异系数均小于10%。本ddPCR方法在动态范围内最低检测限为3.85拷贝/反应,比荧光定量PCR(qPCR)高10倍以上。采用qPCR和ddPCR分别对90份样品进行检测,ddPCR方法阳性检出率为13.33%(12/90)优于qPCR阳性检出率11.11%(10/90)。本文首次建立了单重SADS-CoV ddPCR检测方法,其有更优的可靠性以及抗干扰性,为定量检测动物组织、饲料、血清和粪便等样品中SADS-CoV提供了新的、稳定的技术手段。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 微滴数字PCR 定量检测方法

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我国猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展 被引量：3

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作者 田昊伦 范志新 +3 位作者 孙颖 王凯 冯全文 郭抗抗 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期580-586,共7页

猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV),一种来源于蝙蝠的新型冠状病毒,于2017年1月在华南地区首次被发现,是冠状病毒科(coronaviridae)、α冠状病毒属(alphacoronavirus)的新成员。SADS-CoV主要感染5日龄以内新生仔猪,对初生仔猪的危害... 猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV),一种来源于蝙蝠的新型冠状病毒,于2017年1月在华南地区首次被发现,是冠状病毒科(coronaviridae)、α冠状病毒属(alphacoronavirus)的新成员。SADS-CoV主要感染5日龄以内新生仔猪,对初生仔猪的危害严重。SADS-CoV可引发引起剧烈呕吐、腹泻、严重脱水而导致新生仔猪急性死亡,短短4个月造成广东省4个猪场将近25 000头新生仔猪死亡,给养猪业带来巨大的经济损失。本研究基于SADS-CoV的国内外研究进展,对SADS-CoV的起源、流行概况、病原学、病毒的诊断方法、潜在的跨物种传播风险与防控方面进行综述,以期为该病的预防和控制提供参考。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 病原特征 致病作用 疫病防控

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猪急性腹泻综合征冠状病毒膜蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：1

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作者 段月月 孔祥雨 +4 位作者 袁聪 索学鹏 王琦 郑海学 曹丽艳 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期62-69,共8页

为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)抗膜蛋白(M)多克隆抗体,本研究以SADSCoV GDS04分离株cDNA为模板扩增M基因片段,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组质粒p GEX-6p-1-M。测序正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受... 为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)抗膜蛋白(M)多克隆抗体,本研究以SADSCoV GDS04分离株cDNA为模板扩增M基因片段,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组质粒p GEX-6p-1-M。测序正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,所获得的重组蛋白主要以包涵体形式存在,采用切胶纯化方式进行蛋白纯化。纯化后的M蛋白混合弗氏佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠,经过4次免疫,获得鼠抗M蛋白的多克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹试验(Western-blot)及间接免疫荧光试验(IFA)验证鼠抗M多克隆抗体的反应原性。ELISA结果显示,抗体效价能达到1∶12 800。Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体可以识别重组M蛋白和SADS-CoV感染Huh7细胞表达的M蛋白。IFA结果显示,制备的多克隆抗体可以特异性识别SADS-CoV。以上结果表明,重组的M蛋白不仅具有良好的免疫原性,还具有良好的反应性,为后续SADS-CoV诊断方法的建立及M蛋白生物学功能的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 M蛋白 原核表达 多克隆抗体

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