为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显...为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×10~2~5.64×10~9 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R^2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×10~2 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。展开更多
【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-...【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-Rep;将pET-30a-Rep转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用0.5 mmol/L IPTG诱导表达重组Rep蛋白,利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白。表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA鉴定鼠源多克隆抗体的免疫原性和抗体效价。【结果】成功克隆PCV4 Re p基因,构建了可表达重组Rep蛋白的原核表达质粒;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能被PCV4阳性血清和鼠源多克隆抗体特异性识别,制备的鼠源多克隆抗体效价可达1∶16000。【结论】本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV4重组Rep蛋白,为开发PCV4血清学诊断试剂盒和开展猪场PCV4流行病学调查奠定基础。展开更多
文摘为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×10~2~5.64×10~9 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R^2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×10~2 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。
