致牛腹泻主要病毒四重PCR检测方法的建立与初步应用

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作者 李沫萱 钟林翰 +6 位作者 韩言言 张晓梅 刘伊湄 张梦媛 王美 徐义刚 李园 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第4期67-75,共9页

为了建立能同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)和牛细小病毒(BPV)的四重PCR方法,试验首先分别以BVDV 5′-UTR、BCoV Nsp10、BRV VP6和BPV VP2为靶基因设计检测引物,然后通过优化退火温度、Mg^(2+)体积... 为了建立能同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)和牛细小病毒(BPV)的四重PCR方法,试验首先分别以BVDV 5′-UTR、BCoV Nsp10、BRV VP6和BPV VP2为靶基因设计检测引物,然后通过优化退火温度、Mg^(2+)体积、rTaq酶体积、dNTPs Mix体积和上下游引物体积建立致牛腹泻主要病毒的四重PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、灵敏度和重复性评价,最后应用该方法对临床样本进行检测。结果表明:所建立的四重PCR方法的最优退火温度为55.2℃,最优Mg^(2+)体积为3.0μL,最优rTaq酶体积为0.8μL,最优dNTPs Mix体积为2.5μL,BVDV、BRV、BcoV和BPV对应基因最优的上下游引物分别为1.3μL/1.3μL、0.7μL/0.7μL、1.3μL/1.3μL和0.8μL/0.8μL。该方法仅对靶标病毒检测为阳性,对其他牛源病毒[牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)]和口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗检测均为阴性;对BVDV、BCoV、BRV和BPV的最低检出限分别为1.0×10^(3)copies/μL、1.0×10^(3)copies/μL、1.0×10^(4)copies/μL和1.0×10^(3)copies/μL;对3个批次样本的各个重复均能扩增出目的基因;可准确检测出牛粪便样本组合中已知的病毒;对临床样本中4种病毒的检出率与商品化病毒核酸检测试剂盒的检测结果具有较好的一致性。说明本研究建立的致牛腹泻主要病毒四重PCR检测方法能同时检测BVDV、BCoV、BRV和BPV,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于临床样本的检测。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 牛冠状病毒 牛轮状病毒 牛细小病毒 四重PCR检测方法

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致牛腹泻主要病毒多重实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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作者 张梦媛 钟林翰 +5 位作者 韩言言 刘伊湄 李沫萱 王美 李园 徐义刚 《动物医学进展》 北大核心 2023年第11期26-32,共7页

为鉴别检测引起牛病毒性腹泻的4种主要病原牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCV)、牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)和牛细小病毒(Bovine parvovirus,BPV),分别以BCV Nsp10基因、B... 为鉴别检测引起牛病毒性腹泻的4种主要病原牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCV)、牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)和牛细小病毒(Bovine parvovirus,BPV),分别以BCV Nsp10基因、BVDV 5′UTR基因、BRV VP6基因和BPV VP2基因为靶基因设计引物,建立了检测上述4种病毒的实时荧光定量PCR方法。结果显示,方法的特异性强,仅检测靶标病毒的结果为阳性;方法的灵敏度高,对4种病毒BCV、BVDV、BRV和BPV相应质粒的最低检出限分别为7.77×10^(2)、7.11×10^(1)、1.74×10^(2)和2.53×10^(2)copies/μL,且重复性良好,批内和批间变异系数均小于1.0%。由于上述病毒存在交叉感染的情况较多,因此建立多重荧光定量PCR,并利用建立的多重实时荧光定量PCR方法对采集的230份牛腹泻临床样本进行检测,BVDV、BCV、BRV和BPV的阳性率分别为66.96%、3.48%、18.26%和9.57%;且存在多病毒混合感染情况,其中BVDV和BRV混合感染率为10.43%,BVDV和BPV混合感染率为3.48%,BVDV、BCV和BRV混合感染率为1.74%,BVDV、BCV和BPV混合感染率为0.87%,BVDV、BRV和BPV混合感染率为0.87%。研究建立的多重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、灵敏性,可为病毒性牛腹泻的快速诊断和流行病学调查提供的技术支持。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 牛冠状病毒 牛轮状病毒 牛细小病毒 实时荧光定量PCR

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牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：5

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作者 李振雪 赵飞鹏 +7 位作者 于晓丽 姜艳平 崔文 李一经 唐丽杰 徐义刚 王丽 乔薪瑗 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1136-1142,共7页

为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR Gree... 为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,扩增基因片段长约171 bp,符合目的基因大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的最低检测量为53.3 copies/uL。用该方法检测牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和猪细小病毒,结果显示,只有牛细小病毒可以被检测到,而其他病毒均未被检出,表明该方法具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。结果表明,本研究建立的基于NS1基因的牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性,可用于牛细小病毒感染的检测。 展开更多

关键词 牛细小病毒 NS1基因 实时荧光定量PCR

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动物博卡病毒研究综述 被引量：2

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作者 张烨健 《上海畜牧兽医通讯》 2014年第5期23-24,27,共3页

当前对细小病毒病毒科（Parvoviridae）的病毒进行分类时,可以进一步细分为2个亚科,即感染脊椎动物的细小病毒亚科（Parvovirinae）和感染无脊椎动物的浓病毒亚科（Densovirinae）。细小病毒亚科可以进一步分为5个属,分别是细小病毒属（... 当前对细小病毒病毒科（Parvoviridae）的病毒进行分类时,可以进一步细分为2个亚科,即感染脊椎动物的细小病毒亚科（Parvovirinae）和感染无脊椎动物的浓病毒亚科（Densovirinae）。细小病毒亚科可以进一步分为5个属,分别是细小病毒属（Parvovirus）、嗜红细胞病毒属（Erythrovirus）、依赖病毒属（Dependovirus）、 展开更多

关键词 博卡病毒 细小病毒属 依赖病毒属 病毒亚科 PARVOVIRUS 病毒科 病毒基因组 嗜红细胞 牛细小病毒 非结构蛋白

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牛细小病毒DPO-PCR检测方法的建立 被引量：4

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作者 王孟孟 李振雪 +6 位作者 汤婷婷 王瑞翀 王丽 徐义刚 唐丽杰 李一经 乔薪瑗 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期269-273,共5页

为建立牛细小病毒的快速检测方法,以牛细小病毒VP2基因为靶基因,设计了1对双启动寡核苷酸(dual-priming oligonucleotide,DPO)引物,建立了牛细小病毒DPO-PCR快速检测方法。退火温度不敏感试验、特异性试验和灵敏度试验的结果显示,与常规... 为建立牛细小病毒的快速检测方法,以牛细小病毒VP2基因为靶基因,设计了1对双启动寡核苷酸(dual-priming oligonucleotide,DPO)引物,建立了牛细小病毒DPO-PCR快速检测方法。退火温度不敏感试验、特异性试验和灵敏度试验的结果显示,与常规PCR方法相比,DPO-PCR方法在41～65℃退火温度范围内均能够高效地扩增出目的基因,表明DPO引物对退火温度不敏感;该方法的最低检出量为3.94×10~3copies/uL;通过对牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒进行检测,只有牛细小病毒的检测结果为阳性,且无非特异性扩增。结果表明,建立的DPO-PCR方法同传统PCR方法相比,特异性强、灵敏度高,为牛细小病毒的快速检测提供了一种新方法。 展开更多

关键词 牛细小病毒 DPO-PCR 快速检测

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载bpV(PIC)的神经干细胞联合神经营养素-3壳聚糖支架参与创伤性颅脑损伤后脑神经修复的研究 被引量：2

6

作者 李军 管义祥 +2 位作者 丁锦荣 刘小江 管诚 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2022年第4期446-451,共6页

目的探究载牛细小病毒bpV(PIC)的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合神经营养素3(neurotrophin 3,NT-3)壳聚糖支架对创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后脑神经修复的影响。方法将90只大鼠随机分为对照组、TBI组、TBI+N... 目的探究载牛细小病毒bpV(PIC)的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合神经营养素3(neurotrophin 3,NT-3)壳聚糖支架对创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后脑神经修复的影响。方法将90只大鼠随机分为对照组、TBI组、TBI+NSCs组、TBI+bpV(PIC)-NSCs组、TBI+NT-3壳聚糖组和TBI+bpV(PIC)-NSCs+NT-3组(n=15)。通过撞击构建TBI模型,在撞击后植入NSCs、bpV(PIC)-NSCs、NT-3壳聚糖或者负载bpV(PIC)-NSCs的NT-3壳聚糖。通过mNSS评分和水迷宫实验评估神经功能。通过HE染色和BrdU染色评估脑组织损伤和神经元新生情况。结果TBI组的mNSS评分、脑组织损伤程度、新生神经元数量显著高于对照组,目标象限停留时间、穿越平台次数显著低于对照组(P<0.05)。TBI+NSCs组的mNSS评分和脑组织损伤程度显著低于TBI组,而目标象限停留时间、穿越平台次数和新生神经元数目显著高于TBI组(P<0.05)。TBI+bpV(PIC)-NSCs组的mNSS评分和脑组织损伤程度显著低于TBI+NSCs组,而目标象限停留时间、穿越平台次数和新生神经元数目显著高于TBI+NSCs组(P<0.05)。TBI+bpV(PIC)-NSCs+NT-3组的mNSS评分和脑组织损伤程度显著低于TBI+bpV(PIC)-NSCs组,而目标象限停留时间、穿越平台次数和新生神经元数目显著高于TBI+bpV(PIC)-NSCs组(P<0.05)。结论bpV(PIC)-NSCs联合NT-3壳聚糖支架可显著促进TBI大鼠的神经修复。 展开更多

关键词 创伤性颅脑损伤 神经干细胞 牛细小病毒 壳聚糖支架

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牛细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立 被引量：3

7

作者 赵飞鹏 李木子 +6 位作者 于晓丽 秦松跃 狄亚心 王一晗 姜艳平 崔文 乔薪瑗 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期791-796,共6页

为建立一种快速检测牛细小病毒(BPV)的方法,本研究通过PCR扩增BPV VP2基因,构建pProHTa-BPV-VP2重组表达载体,转化后获得重组大肠杆菌,通过诱导表达获得VP2重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠(100μg/只),经细胞融合、克隆和筛选共获得了5株... 为建立一种快速检测牛细小病毒(BPV)的方法,本研究通过PCR扩增BPV VP2基因,构建pProHTa-BPV-VP2重组表达载体,转化后获得重组大肠杆菌,通过诱导表达获得VP2重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠(100μg/只),经细胞融合、克隆和筛选共获得了5株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为5G9、2B5、6A3、7E8和2B6。经鉴定,其分泌抗体亚型分别为IgG2a、IgG2b、IgM、IgM和IgA。间接免疫荧光结果显示,5株单克隆抗体(MAb)与BPV均可发生特异性反应。同时,将纯化后的BPV VP2重组蛋白免疫新西兰兔,制备兔抗BPV VP2多抗。利用制备的2B5作为检测抗体,BPV VP2多抗作为捕获抗体,初步建立检测BPV的双抗体夹心ELISA方法。该方法的特异性试验结果显示,除BPV外,与牛轮状病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒均不发生反应。敏感性试验结果显示,该方法对BPV最低检出量为3.125×102.8TCID50/mL。重复性试验结果显示,该方法批内、批间变异系数均小于10%。利用该方法对269份临床猪腹泻病料样品进行检测,检出BPV阳性样品14份,与PCR方法符合率达100%。综上,本研究利用抗BPV VP2蛋白的MAb和兔抗BPV VP2多抗建立了双抗体夹心ELISA方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为BPV感染的快速诊断提供一种有效的检测方法,并为流行病学研究和疫病防控提供一种可靠的手段。 展开更多

关键词 牛细小病毒 VP2蛋白 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA

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牛细小病毒的分离鉴定及在不同细胞中的复制动力学研究 被引量：2

8

作者 刘辉 杨红育 +4 位作者 赵红丽 李野 赵虹 李婷婷 丁壮 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1770-1773,共4页

本研究旨在获得牛细小病毒分离株,并对牛细小病毒(BPV)在不同细胞中的复制动力学进行探讨,为牛细小病毒疫苗的开发筛选出合适的病毒株及适宜病毒扩增的细胞株。将96批次牛血清样品分别接种于BT细胞中,盲传3代,逐日观察细胞病变(CPE),对... 本研究旨在获得牛细小病毒分离株,并对牛细小病毒(BPV)在不同细胞中的复制动力学进行探讨,为牛细小病毒疫苗的开发筛选出合适的病毒株及适宜病毒扩增的细胞株。将96批次牛血清样品分别接种于BT细胞中,盲传3代,逐日观察细胞病变(CPE),对出现典型细胞病变的样品采用直接免疫荧光法检测;分离得到1株牛细小病毒,并且对这株病毒的红细胞凝集特性进行分析。通过将牛细小病毒接种在Vero、BT和MDBK 3种细胞中,筛选出适合牛细小病毒培养用的细胞株。结果,通过对96批次牛血清样品接种于BT细胞进行病毒分离培养,获得4株病毒阳性株,使用直接免疫荧光法检测,获得1株牛细小病毒,进行红细胞凝集试验,这株牛细小病毒能凝集豚鼠、马、人的红细胞,但不能凝集家兔、山羊和鸡的红细胞。这株牛细小病毒在BT细胞中可稳定传代,在MDBK和Vero细胞中盲传3代仍未检测到牛细小病毒。结果表明,通过细胞体外培养法分离得到1株牛细小病毒,可以作为牛细小病毒疫苗制备的病毒株,对这株牛细小病毒在不同细胞中的复制动力学的研究结果表明,BT细胞是最适合培养这株牛细小病毒的细胞,候选细胞株MDBK和Vero细胞不适合这株牛细小病毒的扩大培养。本研究为牛细小病毒疫苗的开发奠定了基础。 展开更多

关键词 牛细小病毒 复制动力学 病毒分离

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牛细小病毒病毒样颗粒的组装及其免疫原性评价 被引量：1

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作者 张越 常继涛 于力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期930-934,共5页

为研究牛细小病毒(BPV)VP2衣壳蛋白自组装病毒样颗粒(VLPs)以及VLPs的免疫原性。本研究以BPV-1型C7-5中国分离株的基因组序列为模板扩增VP2蛋白的编码基因,将其克隆至腺病毒穿梭载体p Shuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将VP2... 为研究牛细小病毒(BPV)VP2衣壳蛋白自组装病毒样颗粒(VLPs)以及VLPs的免疫原性。本研究以BPV-1型C7-5中国分离株的基因组序列为模板扩增VP2蛋白的编码基因,将其克隆至腺病毒穿梭载体p Shuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将VP2基因插入腺病毒骨架质粒p Ad Easy-1中,获得携带BPV VP2基因的重组腺病毒质粒(p Ad-BPV-VP2)。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染Ad293细胞,获得重组腺病毒r Ad-BPV-VP2,第8代时滴度为107.25TCID50/m L。间接免疫荧光、western blot以及电镜观察结果显示,BPV VP2蛋白可以在腺病毒系统中稳定表达,并有效组装VLPs。将r Ad-BPV-VP2肌肉注射免疫BALB/c小鼠,结果显示,针对BPV的血清Ig G和中和(VN)抗体分别于加强免疫后2周和8周达最高水平,高峰抗体可持续至15周,VN抗体的最高滴度可达1∶4 000。此外,与对照小鼠血清相比,免疫小鼠血清中的IL-2、IL-4及IFN-γ含量显著升高(p<0.05)。结果表明,r Ad-BPV-VP2免疫小鼠后可以诱导机体产生针对BPV的特异性体液和细胞免疫。本研究为BPV的免疫预防及载体的开发奠定了基础。 展开更多

关键词 牛细小病毒 病毒样颗粒 免疫原性

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牛细小病毒VP2基因分段表达及其抗原性分析 被引量：1

10

作者 罗济冠 葛俊伟 +4 位作者 姜艳平 崔文 乔薪瑗 唐丽杰 李一经 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期546-549,共4页

为研究牛细小病毒(BPV)VP2蛋白免疫学相关功能,本研究采用PCR扩增得到BPV-1VR767株VP2基因片段,测序后利用生物学软件分析VP2蛋白的抗原表位,选取抗原表位富集的3个基因片段VP2-1(100 bp～789 bp),VP2-2(898 bp～1 353 bp)和VP2-3(1 450... 为研究牛细小病毒(BPV)VP2蛋白免疫学相关功能,本研究采用PCR扩增得到BPV-1VR767株VP2基因片段,测序后利用生物学软件分析VP2蛋白的抗原表位,选取抗原表位富集的3个基因片段VP2-1(100 bp～789 bp),VP2-2(898 bp～1 353 bp)和VP2-3(1 450 bp～1 899 bp)分别克隆至原核表达载体pET-28a中,并转化E.coli中进行诱导表达。表达的重组蛋白经western blot和间接ELISA鉴定;用纯化的重组蛋白分别免疫小鼠,并用ELISA检测小鼠多克隆抗体特异性。结果显示:表达的3种重组蛋白分子量分别约为30.2 ku、22.9 ku和22.7 ku,均可以被BPV阳性血清识别。间接ELISA结果表明,3种重组蛋白均能够有效诱导抗体反应。其中,重组VP2-3诱导产生的抗体效价最高,与阳性血清的结合能力最强。该研究结果为研究VP2蛋白功能、建立BPV检测方法提供了基础材料。 展开更多

关键词 牛细小病毒 VP2基因 表达 抗原性分析

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犬源牛犬细小病毒和犬圆环病毒二联PCR检测方法的建立及应用 被引量：1

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作者 于永乐 姚延珠 +6 位作者 韩先杰 张传美 秦志华 杨瑞梅 张洪亮 刘维全 单虎 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期978-982,共5页

本研究旨在建立可同时检测犬源牛犬细小病毒(CBoV)和犬圆环病毒(CCV)的二联PCR检测方法,并对两种病毒病当前的流行情况进行监测和调查。分别将已发表的CBoV和CCV基因组序列进行同源性比对,选择高同源区段,应用Primer Primier 5计算机软... 本研究旨在建立可同时检测犬源牛犬细小病毒(CBoV)和犬圆环病毒(CCV)的二联PCR检测方法,并对两种病毒病当前的流行情况进行监测和调查。分别将已发表的CBoV和CCV基因组序列进行同源性比对,选择高同源区段,应用Primer Primier 5计算机软件设计并合成了2对特异性扩增引物,目的片段大小分别为170 bp(CBoV)和239 bp(CCV)。分别提取CBoV和CCV重组质粒作为模板,进行二联PCR扩增试验。结果表明,本研究成功建立了可同时检测CBoV和CCV的二联PCR检测方法。并对其重复性、特异性和灵敏度进行验证,二联PCR最低检测限度为3.0 pg总DNA,而对犬细小病毒2型、犬瘟热病毒和犬副流感病毒的PCR检测结果均为阴性。对送检的30份病料进行检测,其中,4份为CBoV阳性,3份为CCV阳性,未检测到混合感染。综上所述,本研究所建立的CBoV和CCV二联PCR诊断方法特异性高,敏感性好,可用于临床犬腹泻病的流行病学调查。 展开更多

关键词 犬源牛犬细小病毒 犬圆环病毒 二联PCR

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