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牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达及条件优化 被引量：6
1
作者 朱善元 王安平 +4 位作者 王永娟 成大荣 吴双 左伟勇 洪伟鸣 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期19-23,共5页
根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)序列和酵母密码子偏爱性设计并合成一段bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母pPIC9K质粒连接后构建了分泌表达载体pPIC9K-bTAP。获得重组质粒经SalⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选获得了阳... 根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)序列和酵母密码子偏爱性设计并合成一段bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母pPIC9K质粒连接后构建了分泌表达载体pPIC9K-bTAP。获得重组质粒经SalⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选获得了阳性转化重组菌。通过对重组菌培养条件的进一步优化,揭示了重组蛋白bTAP可在含2%酸水解酪蛋白的BMMY培养基中经0.5%甲醇在28℃诱导表达72h后获得最优表达。抑菌试验表明bTAP对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。 展开更多
关键词 牛气管抗菌肽 毕赤酵母 表达 优化 抑菌活性
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牛气管抗菌肽在山羊乳腺组织中的表达 被引量：4
2
作者 王铁东 逄大欣 欧阳红生 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2009年第8期7-11,共5页
根据已经发表的牛气管抗菌肽(bTAP)cDNA序列设计4条短的寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR的方法合成bTAP基因,将其克隆至pMD-18T载体,序列测定正确后,构建bTAP基因的乳腺组织特异性表达载体pBcp-bTAP,将其溶于生理盐水后直接注射山羊乳腺小叶... 根据已经发表的牛气管抗菌肽(bTAP)cDNA序列设计4条短的寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR的方法合成bTAP基因,将其克隆至pMD-18T载体,序列测定正确后,构建bTAP基因的乳腺组织特异性表达载体pBcp-bTAP,将其溶于生理盐水后直接注射山羊乳腺小叶,使bTAP基因在乳腺组织内表达,收集注射质粒前后的奶样,测试奶样对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌的抑制能力,结果显示注射pBcp-bTAP后的奶样表现出对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用,这种抑制活性可以持续至20h以上。 展开更多
关键词 牛气管抗菌肽 乳腺 基因表达
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牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达与鉴定 被引量：4
3
作者 王安平 李哲峰 +6 位作者 朱善元 王永娟 吴双 黄文强 左伟勇 洪伟鸣 孙怀昌 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第6期1316-1320,共5页
为了在毕赤酵母中获得牛气管抗菌肽(bTAP)的表达,根据已发表的牛气管抗菌肽序列和毕赤酵母对密码子的偏爱性设计2对引物,采用重叠延伸PCR法获得bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母(Pichia pastoris)pPIC9K质粒连接,构建表达载体pPIC9K-bTAP。... 为了在毕赤酵母中获得牛气管抗菌肽(bTAP)的表达,根据已发表的牛气管抗菌肽序列和毕赤酵母对密码子的偏爱性设计2对引物,采用重叠延伸PCR法获得bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母(Pichia pastoris)pPIC9K质粒连接,构建表达载体pPIC9K-bTAP。用SalⅠ酶切线性化pPIC9K-bTAP质粒后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导其表达。SDS-PAGE分析结果表明表达的重组蛋白质分子量正确,抑菌试验结果表明表达的重组蛋白质bTAP对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。 展开更多
关键词 牛气管抗菌肽 毕赤酵母 表达 抗菌活性
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牛气管抗菌肽的原核表达、体外抗菌活性及其组织分布分析 被引量：4
4
作者 高小艳 王长法 +5 位作者 刘顺德 李秋玲 杨宏军 杨少华 仲跻峰 何洪彬 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1166-1171,共6页
本文旨在对牛气管抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide,TAP)基因进行原核表达,以及研究重组蛋白的抗菌活性,并分析TAP在各组织的表达分布情况,为开展转TAP基因抗乳腺炎奶牛研究提供技术资料。作者采用RT-PCR从荷斯坦奶牛气管扩增TAP... 本文旨在对牛气管抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide,TAP)基因进行原核表达,以及研究重组蛋白的抗菌活性,并分析TAP在各组织的表达分布情况,为开展转TAP基因抗乳腺炎奶牛研究提供技术资料。作者采用RT-PCR从荷斯坦奶牛气管扩增TAP基因,分析其序列后根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏好性,人工合成牛TAP基因,构建pET32a(+)-TAP重组质粒;然后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并纯化。对表达蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定;在线软件分析目的蛋白表达量。采用滤纸片法测定重组牛TAP的体外抗菌活性,并用RT-PCR法分析牛各组织中TAP表达情况。测序结果表明,扩增到114bp目的基因片段,可编码含38个氨基酸残基的成熟蛋白。SDS-PAGE分析表达的融合蛋白相对分子质量为24ku,重组蛋白以可溶性方式存在,表达量占菌体总蛋白的52.1%。Western Blot检测只出现单一条带。抗菌效价分析表明0.115μg·μL-1重组蛋白对牛源金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性。TAP基因在奶牛咽喉、肺、气管、小肠、肝、心脏及口腔黏膜中均有表达,在鼻黏膜和舌黏膜中微量表达,在皮肤中几乎不表达。作者成功表达了牛TAP基因,重组牛TAP蛋白在大肠杆菌中实现高效表达,并具有一定的抗奶牛乳腺炎致病菌的活性,为未来培育抗乳腺炎转基因奶牛及相关基因工程产品的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 牛气管抗菌肽 表达 抗菌活性 组织分布 乳腺炎
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牛气管抗菌肽cDNA的克隆与表达 被引量：1
5
作者 王永娟 王安平 孙怀昌 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第19期1651-1655,共5页
目的:开发一种有效抑制动物细菌感染的重组抗菌肽。方法:根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP) mRNA序列设计引物,用RT-PCR从奶牛气管上皮细胞总RNA中扩增出214bp的bTAP cDNA,将其克隆入pUCm-T载体进行序列测定,将此cDNA分别克隆入真核表达载... 目的:开发一种有效抑制动物细菌感染的重组抗菌肽。方法:根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP) mRNA序列设计引物,用RT-PCR从奶牛气管上皮细胞总RNA中扩增出214bp的bTAP cDNA,将其克隆入pUCm-T载体进行序列测定,将此cDNA分别克隆入真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pGEX-6p-1进行表达研究。结果:测序结果与已发表的bTAP序列有3个碱基差异,其中2个导致氨基酸替换;经微球菌溶解试验证明,注射在小鼠皮下的重组质粒pcDNA-tap能表达有活性的bTAP;抗体测定结果显示重组质粒pcDNA-tap经5次免疫后家兔产生的抗hTAP抗体效价达1:800;经IPTG诱导后,含重组质粒pGEX-tap大肠杆菌能表达预计大小的GST-bTAP融合蛋白,且能被兔抗bTAP识别。结论:本研究克隆的bTAP cDNA可用于表达研究及相关基因工程产品的开发。 展开更多
关键词 牛气管抗菌肽 CDNA 克隆 表达
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牛气管黏膜抗菌肽成熟肽基因的克隆及序列分析 被引量：1
6
作者 王金涛 程广东 徐世文 《生物技术通讯》 CAS 2006年第4期550-552,共3页
目的:获得牛气管黏膜抗菌肽(bTAP)成熟肽的基因序列,为后续的研究工作奠定基础。方法:从新屠宰的黄牛气管黏膜中提取总RNA,反转录获得cDNA,以此cDNA为模板进行PCR扩增目的片段,并将其克隆至pMD18-T载体中,经鉴定随机挑选1个阳性重组子... 目的:获得牛气管黏膜抗菌肽(bTAP)成熟肽的基因序列,为后续的研究工作奠定基础。方法:从新屠宰的黄牛气管黏膜中提取总RNA,反转录获得cDNA,以此cDNA为模板进行PCR扩增目的片段,并将其克隆至pMD18-T载体中,经鉴定随机挑选1个阳性重组子进行测序,将测序结果与已报道的序列进行比较,并做NCBIBlast比对。结果:PCR扩增出bTAP成熟肽基因,核苷酸序列测定验证了其正确性;NCBIBlast比对表明,与bTAP成熟肽基因同源性较高的分别是牛β-防御素11、牛β-防御素12、牛β-防御素402、牛β-防御素403、绵羊β-防御素1、绵羊β-防御素2、山羊β-防御素1及山羊β-防御素2,核苷酸序列同源性分别为78.07%、78.95%、80.70%、83.33%、83.33%、80.70%、81.58%和81.58%,氨基酸序列同源性分别为68.42%、65.79%、68.42%、76.32%、71.05%、63.16%、63.16%和68.42%。结论:成功克隆了bTAP成熟肽的基因序列,NCBIBlas比对表明bTAP与防御素可能来自一个共同的祖系基因。 展开更多
关键词 牛气管黏膜抗菌肽 克隆 序列分析 NCBI BLAST
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