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鸡毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20的克隆表达与蛋白定位
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作者 张知之 冯茜茜 +4 位作者 范雪莲 刘丹丹 候照峰 许金俊 陶建平 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期893-901,共9页
克隆、表达毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20,检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫子孢子的总RNA为模板,用RT-PCR扩增EnsHsp20基因后,连接至pGEM-T Easy载体;测序后构建pET28a(+)-EnsHsp20表达载体,转化... 克隆、表达毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20,检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫子孢子的总RNA为模板,用RT-PCR扩增EnsHsp20基因后,连接至pGEM-T Easy载体;测序后构建pET28a(+)-EnsHsp20表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3);经双酶切和测序鉴定后,将重组菌诱导表达;表达产物经Western-blot鉴定、纯化与复性后,免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗rEnsHsp20多克隆抗体;利用多克隆抗体,分别用Western-blot和间接免疫荧光试验检测子孢子和第2代裂殖子中EnsHsp20的天然蛋白及其定位;最后,应用qRT-PCR分析EnsHsp20基因在未孢子化卵囊、子孢子和第2代裂殖子中的转录水平。结果显示,该基因全长549 bp,编码183个氨基酸,预测分子质量为20.3 ku;重组蛋白主要以包涵体形式存在,可以被6×His标签单抗和鸡抗毒害艾美耳球虫、抗柔嫩艾美耳球虫、抗堆型艾美耳球虫和抗巨型艾美耳球虫的阳性血清识别;在第2代裂殖子中检测到EnsHsp20的天然蛋白,分子质量约为36 ku;EnsHsp20蛋白定位在子孢子和第2代裂殖子的细胞膜或细胞质;EnsHsp20基因在子孢子中的转录水平极显著高于第2代裂殖子和未孢子化卵囊(P<0.01)。本研究结果为进一步探析EnsHsp20蛋白在虫体入侵与生长发育中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 毒害艾美耳球虫 热休克蛋白20基因 克隆 表达 定位
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