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树鼩水动力转染方法的建立及在HBV模型探索中的应用 被引量：8
1
作者 周勇 阎少多 +4 位作者 闫虎 段相国 王纪东 章金刚 詹林盛 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期742-745,共4页
目的建立一种水动力注射将外源基因导入树鼩肝脏的方法,并用此方法建立HBV树鼩模型。方法用萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)作为报告基因,通过树鼩大隐静脉将报告基因用水动力注射方... 目的建立一种水动力注射将外源基因导入树鼩肝脏的方法,并用此方法建立HBV树鼩模型。方法用萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)作为报告基因,通过树鼩大隐静脉将报告基因用水动力注射方法导入树鼩肝脏,活体成像和β-Gal染色观察水动力转染效果。将pHBV1.2质粒用水动力注射方法转入树鼩肝脏,检测树鼩血清中ALT、实时荧光定量检测血清中HBV DNA,ELISA检测血清中HBsAg、HBsAb。结果通过大隐静脉水动力注射,报告基因能够在肝脏特异性表达,转染HBV1.2质粒后树鼩血清中能够检测到相关阳性指标。结论大隐静脉水动力注射法能够作为树鼩肝脏外源基因导入的一种方法,并用此方法初步探索了树鼩的HBV模型。 展开更多
关键词 树鼩 水动力注射 肝炎病毒 乙型 动物模型
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体内转导HBVcccDNA法建立HBV慢性感染的小鼠模型 被引量：7
2
作者 赵婷婷 李小松 +5 位作者 殷文伟 蔡雪飞 张文露 陈飞兰 赖国旗 黄爱龙 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期260-265,共6页
目的通过体内转导乙型肝炎病毒（HBV）cccDNA，建立持续表达HBV抗原的小鼠乙型肝炎模型。方法取10只裸小鼠，将HBVcccDNA以3μg／只、2μg／只、1ug／只分别注射实验组，同时以2ml等渗盐水注射空白组，分别于第1、3天，第1、2、3、4、5... 目的通过体内转导乙型肝炎病毒（HBV）cccDNA，建立持续表达HBV抗原的小鼠乙型肝炎模型。方法取10只裸小鼠，将HBVcccDNA以3μg／只、2μg／只、1ug／只分别注射实验组，同时以2ml等渗盐水注射空白组，分别于第1、3天，第1、2、3、4、5、6、8、10周进行尾静脉采血。用放射免疫法检测血清中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎e抗原（HBeAg）浓度的变化；荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBVDNA拷贝数；免疫组织化学法检测肝组织中HBV抗原特异性;苏木素-伊红（HE）染色观察肝组织病理变化。使用SPSS17．0对数据间相关性进行线性相关分析。结果小鼠在注射cccDNA后，从第1天开始于血液中检测到HBsAg和HBeAg的表达，两者均于第1周内迅速升高达到最高值，并持续至第10周；其中HBsAg的表达水平经历了两个先上升再下降的过程（第4周为较低水平，第8周为较高水平），而HBeAg的表达水平经历了三个先上升再下降的过程（第2周、第4周为较低水平，第3周、第6周为较高水平）；荧光定量PCR结果表明，10周后肝组织中HBVDNA的拷贝数随着高、中、低剂量组而递减，每克肝组织中HBVDNA拷贝数[（1．14E＋07）±（6．51E＋06）、（9．81E＋06）±（9．32E＋06）、（3．72E＋06）±（2．35E＋06）]与注射的cccDNA浓度（1．5、1．0、0．5μg／m1）呈正相关（皮尔森相关系数，=0．979）。10周后血清中HBVDNA的拷贝数为中剂量组最高，其次为高剂量组，同时，各组血清中的HBVDNA拷贝数较肝组织中的低；免疫组织化学结果显示，实验组裸小鼠肝组织中存在HBsAg和HBcAg的表达，HE染色结果显示肝组织脂肪样或空泡样变性严重，肝小叶组织结构不明显。结论本研究利用HBVcccDNA质粒体内转导裸小鼠，成功建立了HBV在肝组织稳定复制并持续表达HBV抗原的裸小鼠模型，为进一步研究HBVcccDNA慢性持续感染 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 DNA 共价闭合环状 水动力注射 持续感染
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体外实时动态监测水动力注射分泌型荧光素酶基因的表达 被引量：6
3
作者 田文洪 王刚 +4 位作者 罗顺涛 董小岩 付昕阳 谭文杰 吴小兵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1552-1557,共6页
为了建立体外实时动态监测转导基因的体内表达,本研究选择分泌型的荧光素酶基因Gluc作为报告基因,对其体内外表达特性和检测方法进行了研究。首先构建了Gluc表达质粒pAAV2neo-Gluc。将pAAV2neo-Gluc转染体外培养的Huh7、HepG2细胞后,细... 为了建立体外实时动态监测转导基因的体内表达,本研究选择分泌型的荧光素酶基因Gluc作为报告基因,对其体内外表达特性和检测方法进行了研究。首先构建了Gluc表达质粒pAAV2neo-Gluc。将pAAV2neo-Gluc转染体外培养的Huh7、HepG2细胞后,细胞培养上清和细胞裂解液中分别检测到Gluc的活性,而上清比细胞中的含量高约100倍。表明表达的Gluc以分泌形式为主。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neo-Gluc质粒,活体成像表明Gluc在小鼠体内呈全身分布,而注射了萤火虫荧光素酶质粒pAAV2neo-Fluc的对照小鼠则主要在肝脏显像。将剂量分别为0.1、1、10、50μg每只的pAAV2neo-GlucDNA用水动力法尾静脉注射小鼠,不同时间点连续尾静脉采血测定其中的Gluc酶活性,观察其Gluc体内表达和分泌的动态变化。结果显示,各剂量组的Gluc表达变化规律高度一致:注射后2h即可检测到Gluc表达,10h后达到高峰,之后逐渐下降;Gluc的表达水平与注射质粒DNA的量呈正相关;为了进一步观察Gluc检测的灵敏性,本研究又比较了注射更低的质粒剂量(包括0.001、0.01和0.1μg每只)时Gluc体内表达情况。结果发现注射剂量低至0.001μg每只小鼠都能在血中检测到Gluc表达,这一结果提示了Gluc检测的高度灵敏性。本研究首次报道了以Gluc为报告基因体外实时动态监测水动力注射基因的表达规律,为动态分析水动力注射基因的体内表达调控及功能研究提供了新的有效手段。 展开更多
关键词 水动力注射 基因表达 Gluc 监测 EX VIVO
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双萤光素酶共表达载体构建及特性研究 被引量：4
4
作者 付昕阳 王刚 +4 位作者 田文洪 陈素云 董小岩 吴小兵 谭万龙 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期276-282,共7页
利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2... 利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。将重组质粒瞬时转染BHK-21细胞,24h后在细胞上清液和细胞裂解液中均能检测到Gluc和Fluc的表达,其中Gluc98%以上分布在上清液中,而Fluc98%以上存在于细胞中,随时间延长Gluc活性在上清液中逐步增加,而细胞内Fluc活性则保持相对平稳。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒DNA,通过尾静脉微量采血(2.5μl/次)即可实时地监测体内Gluc的表达情况。活体成像结果显示,注射Gluc的底物腔肠素时小鼠明显表现为全身显像,显像在10min内迅速衰减;而注射Fluc的底物D-Luciferin时显像主要集中在肝脏,显像在30min内都比较稳定。本研究设计和构建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒实现了分泌型和非分泌型萤光素酶的共表达,既可以在不裂解细胞或处死动物的情况下直接在细胞培养上清或血液中动态检测Gluc的活性,又可以利用活体成像技术准确定位Fluc表达部位,比单一的萤光素酶报告载体在细胞标记和体内示踪研究方面更具优越性。 展开更多
关键词 Gaussia萤光素酶 萤火虫萤光素酶 TaV2A 水动力注射 共表达
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用分泌型萤光素酶报告系统比较TTR启动子与CMV启动子的体内外表达特性 被引量：2
5
作者 罗顺涛 田文洪 +3 位作者 王刚 董小岩 杨莉 吴小兵 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期424-429,共6页
GLuc（GaussiaLuciferase）是一种高灵敏度分泌型萤光素酶。本研究利用GLuc的易分泌、高灵敏性和检测方法简单快速的特点,初步比较了TTR启动子（PTTR）与CMV启动子（PCMV）的体内外表达特性。首先构建了两种启动子-报告基因表达质粒pAAV... GLuc（GaussiaLuciferase）是一种高灵敏度分泌型萤光素酶。本研究利用GLuc的易分泌、高灵敏性和检测方法简单快速的特点,初步比较了TTR启动子（PTTR）与CMV启动子（PCMV）的体内外表达特性。首先构建了两种启动子-报告基因表达质粒pAAV2-neo-TTR-GLuc和pAAV2-neo-CMV-GLuc。用脂质体转染法将它们分别转染至两株肝细胞源的细胞株Huh7与HepG2以及两株非肝细胞源细胞株HEK293与HeLaS3。在转染后不同时间点取细胞培养上清液检测GLuc的表达。此外采用水动力注射法,将这两种质粒分别以注射剂量0.1μg、1μg和10μg/只经尾静脉注射至BALB/c小鼠体内,注射后2h开始在不同时间点上经尾静脉采集全血（2.5μl/次）并测定血液中的GLuc水平。细胞实验结果显示,PCMV介导的GLuc表达都明显高于PTTR;然而,在HEK293和HeLaS3细胞中PCMV比PTTR的表达水平高50-300倍,而在Huh7和HepG2中仅高10倍以内,提示PTTR具有相对的肝细胞特异性。在小鼠实验中,PCMV介导的GLuc表达在各剂量组中也明显高于PTTR,然而它们表达水平变化特征明显不同：PCMV介导的GLuc表达在质粒注射后约10h达到最大值，此后迅速下降；而PTTR介导的GLuc表达在质粒注射后约48h达到峰值，随后缓慢下降。上述实验结果提示，PTTR虽然在表达强度方面不及PCMV但其介导的表达水平维持长时间，下降较缓慢，比较适于目的基因在肝脏内的较长时间表达。 展开更多
关键词 分泌型萤光素酶 水动力注射 启动子 转甲状腺素蛋白 巨细胞病毒
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乙型肝炎病毒-三磷酸-小干扰核糖核酸抑制小鼠乙型肝炎病毒复制并激活β干扰素的表达
6
作者 邢雅玲 陈晓娟 +4 位作者 闫飞 杜鹃 周勇 王学军 陈忠斌 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期517-521,共5页
目的：观察 HBV-三磷酸（3p）-小干扰 RNA（siRNA）激活受试小鼠Ⅰ型干扰素抗病毒天然免疫反应以及抑制 HBV 基因组复制的双重作用。方法针对 HBV 基因组 S/P mRNA 设计并通过体外转录法制备带有5′-3p-修饰的 HBV-3p-siRNA；以未经修饰... 目的：观察 HBV-三磷酸（3p）-小干扰 RNA（siRNA）激活受试小鼠Ⅰ型干扰素抗病毒天然免疫反应以及抑制 HBV 基因组复制的双重作用。方法针对 HBV 基因组 S/P mRNA 设计并通过体外转录法制备带有5′-3p-修饰的 HBV-3p-siRNA；以未经修饰的 HBV-siRNA 和阴性对照（NC）-siRNA 作为对照；利用尾静脉水动力注射法建立 HBV 感染小鼠模型。将40只小鼠分为4组，每组10只，模型组：仅注射 pGL3．0-HBV 1．2拷贝质粒；阴性对照组：腹腔注射 NC-siRNA；HBV-siRNA 组：腹腔注射 HBV-siRNA；HBV-3p-siRNA 组：腹腔注射 HBV-3p-siRNA。ELISA 法检测小鼠血清中HBsAg 的表达和β干扰素的分泌量；荧光定量 PCR 检测小鼠血清 HBV DNA。采用 LSD 或 Dunnett T3统计方法进行 One way-ANOVA 统计学分析。结果小鼠血清中β干扰素水平模型组为（12．37±5．32）pg/mL，阴性对照组为（22．61±6．29）pg/mL，HBV-siRNA 组为（26．40±5．39）pg/mL，HBV-3p-siRNA 组为（68．37±21．00）pg/mL，HBV-siRNA 组和 HBV-3p-siRNA 组与模型组相比，差异有统计学意义（F 值分别为23．988、46．523，均 P ＜0．01）。小鼠血清中 HBsAg 水平模型组为（2864．86±907．11）ng/mL，阴性对照组为（2198．86±456．89）ng/mL，HBV-siRNA 组为（1049．71±396．28）ng/mL， HBV-3p-siRNA 组为（640．86±383．08）ng/mL，HBV-siRNA 组和 HBV-3p-siRNA 组与模型组相比，差异有统计学意义（F 值分别为23．537、39．144，P 值分别为0．025、0．010）。小鼠血清中 HBV DNA 的水平模型组为（2．54×104^±1．46×10^4）拷贝/mL，阴性对照组为（2．22×10^4±2．62×10^3）拷贝/mL， HBV-siRNA组为（3．59×10^3±2．88×10^3）拷贝/mL，HBV-3p-siRNA 组为（2．65×10^3±1.46×10^3）拷贝/mL，HBV-siRNA 组和 HBV-3p-siRNA 组与模型组相比，差异均有统计学意义（F 值分别为15．013、16．741，均 P ＜0．05）。HBV-3p-siRNA、HBV-siRNA，以及 NC-siRNA 对 HBV 感 展开更多
关键词 3p—siRNA 抗病毒天然免疫 肝炎病毒 乙型 水动力注射 小鼠
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CRISPR系统特异性敲除目的基因在肝病小鼠模型中的应用
7
作者 马月 莫丽 +2 位作者 方杰 张欢欢 余陈欢 《国际流行病学传染病学杂志》 CAS 2017年第3期151-155,共5页
目的利用腺相关病毒（AAV）转导和CRISPR技术建立肝脏相关疾病小鼠模型。方法AAV-绿色荧光蛋白（GFP）表达系统（AAV-GFP）和CRISPR靶向基因敲除质粒系统（px330-sgGFP—Cas9），三组FVB／NJ小鼠采用尾静脉高压水动力注射技术分别注射... 目的利用腺相关病毒（AAV）转导和CRISPR技术建立肝脏相关疾病小鼠模型。方法AAV-绿色荧光蛋白（GFP）表达系统（AAV-GFP）和CRISPR靶向基因敲除质粒系统（px330-sgGFP—Cas9），三组FVB／NJ小鼠采用尾静脉高压水动力注射技术分别注射生理盐水（对照组）、AAV-GFP（AAV-GFP组）、AAV—GFP＋px330-sgGFP-Cas9（sgGFP组），采用小动物活体成像仪检测小鼠肝脏GFP表达情况。结果生理盐水对照组小鼠肝脏不表达GFP；AAV—GFP组小鼠肝脏72h后开始表达GFP，2周后GFP表达稳定；sgGFP组在第9、12天均表达GFP蛋白，但2周后GFP蛋白明显减弱。结论本研究所构建的AAV—GFP表达系统能够在小鼠肝脏中稳定表达GFP。所构建的CRISPR质粒系统可以特异性敲除小鼠肝脏所携带的目的基因，建立合适的肝脏疾病研究模型。 展开更多
关键词 质粒 CRISPR技术 腺相关病毒系统 水动力注射技术
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水动力尾静脉注射介导Akt/β-catenin/Yap质粒转染建立小鼠肝癌模型 被引量：1
8
作者 蒋雨薇 宋海燕 +6 位作者 李怡萍 汤凯悦 徐娇雅 SULAIMAN Andrew MCGARRY Sarah WANG Lisheng 郑培永 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期1185-1190,共6页
目的通过应用水动力尾静脉注射(hydrodynamic tail vein injection,HTVi)Sleeping Beauty(SB)质粒及促癌基因质粒,构建一种新型小鼠肝癌模型。方法6周龄雄性C57BL/6J小鼠,按照体重随机分为对照组和模型组。将冻存的SB、Akt、β-catenin... 目的通过应用水动力尾静脉注射(hydrodynamic tail vein injection,HTVi)Sleeping Beauty(SB)质粒及促癌基因质粒,构建一种新型小鼠肝癌模型。方法6周龄雄性C57BL/6J小鼠,按照体重随机分为对照组和模型组。将冻存的SB、Akt、β-catenin、Yap质粒转化入感受态E.coli DH5α大肠杆菌,于LB培养基扩增后提取质粒。每只模型组小鼠尾静脉快速注射上述质粒混合溶液2 mL,包含SB质粒5μg,Akt、β-catenin、Yap质粒分别15μg,对照组小鼠给予等量PBS尾静脉注射。继续饲养8周后处死小鼠,观察小鼠情况,记录体重、肝重。观察小鼠肝脏病理学变化,并应用Western blot法检测小鼠肝组织中Akt、β-catenin、Yap基因表达水平。结果高压注射质粒8周后,对照组小鼠活动度好,皮毛光亮;小鼠肝脏形态正常;肝组织HE染色显示,对照组小鼠肝小叶结构完整。模型组小鼠活动减少,皮毛无光泽。与对照组比较,模型组小鼠体重下降、肝重增加、肝体比显著上调;模型组小鼠肝脏体积增大,质地较硬,表面出现颗粒状、结节样改变;肝组织HE染色显示,模型组小鼠肝组织结构紊乱,并出现多个肿瘤结节。此外,与对照组相比,模型组小鼠肝组织中Akt、β-catenin、Yap基因表达均明显上调。结论应用水动力尾静脉注射SB质粒及Akt/β-catenin/Yap质粒的方法可成功建立小鼠肝癌模型,为肝癌发病机制及药物研发提供快速、经济的动物模型。 展开更多
关键词 肝肿瘤 动物模型 水动力尾静脉注射 SB质粒 癌基因
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