微生物酶法消除黄酒中氨基甲酸乙酯研究进展 被引量：17

1

作者 刘庆涛 康振 堵国成 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期567-576,共10页

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)具有致癌性,广泛存在于酒精饮料中。我国的黄酒因EC含量高而带来的食品安全问题越来越受到人们的关注。微生物酶法消除黄酒中的EC具有直接、高效的特性而被深入研究。文中从黄酒中EC的形成机制、酸性... 氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)具有致癌性,广泛存在于酒精饮料中。我国的黄酒因EC含量高而带来的食品安全问题越来越受到人们的关注。微生物酶法消除黄酒中的EC具有直接、高效的特性而被深入研究。文中从黄酒中EC的形成机制、酸性脲酶研究现状、氨基甲酸乙酯水解酶研究现状等方面概述了微生物酶法消除黄酒中EC的研究进展及存在的问题。并针对这些问题,提出了寻找新型氨基甲酸乙酯水解酶、Fe^(3+)依赖型双功能酸性脲酶食品级表达与定向进化及双酶并用将尿素和EC一起消除的策略。 展开更多

关键词 食品安全 氨基甲酸乙酯 微生物酶法 酸性脲酶 氨基甲酸乙酯水解酶 黄酒

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氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质 被引量：13

2

作者 李京京 方芳 +3 位作者 张继冉 刘龙 堵国成 陈坚 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1239-1245,共7页

氨基甲酸乙酯是发酵食品生产过程中的副产物,具有致癌性和遗传毒性,影响食品安全.酶法降解氨基甲酸乙酯是一种高效安全的去毒方法.从小鼠肠道筛选得到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌.通过对其细胞破碎上清液进行硫酸铵... 氨基甲酸乙酯是发酵食品生产过程中的副产物,具有致癌性和遗传毒性,影响食品安全.酶法降解氨基甲酸乙酯是一种高效安全的去毒方法.从小鼠肠道筛选得到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌.通过对其细胞破碎上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶层析分离纯化,得到了氨基甲酸乙酯水解酶纯酶.SDS-PAGE电泳图显示,该酶亚基分子量约为50 kDa.该酶最适反应温度为35℃,最适pH值为7.0,在10～45℃时,具有良好的热稳定性.以氨基甲酸乙酯为底物反应,其Km和Kcat分别为37.2 mmol/L和1 176.4 s-1.金属离子显著抑制酶活力,而EDTA对酶活力无影响,表明此酶为非金属酶.此外,该酶对低浓度的NaC1和乙醇有一定的耐受性,具有在酱油和黄酒中去除氨基甲酸乙酯的应用潜力. 展开更多

关键词 赖氨酸芽孢杆菌 氨基甲酸乙酯 氨基甲酸乙酯水解酶 分离纯化 酶学性质

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耐盐氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质 被引量：10

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作者 卜攀攀 陈坚 堵国成 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期404-411,共8页

氨基甲酸乙酯是发酵食品中存在的一种致癌物质,酶法去除发酵食品中的氨基甲酸乙酯是消除氨基甲酸乙酯危害的一种重要方法。从小鼠的胃部获得了一株产氨基甲酸乙酯水解酶的肺炎克雷伯氏菌,为了解该氨基甲酸乙酯水解酶的酶学性质,从肺炎... 氨基甲酸乙酯是发酵食品中存在的一种致癌物质,酶法去除发酵食品中的氨基甲酸乙酯是消除氨基甲酸乙酯危害的一种重要方法。从小鼠的胃部获得了一株产氨基甲酸乙酯水解酶的肺炎克雷伯氏菌,为了解该氨基甲酸乙酯水解酶的酶学性质,从肺炎克雷伯氏菌中提取获得氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液,经硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析分离得到氨基甲酸乙酯水解酶纯酶。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析,估计该酶的分子量约为55 kDa。其水解氨基甲酸乙酯的Km值为74 mmol/L。酶反应的最适温度为55℃,最适pH为7.0。乙二胺四乙酸(EDTA)和二硫苏糖醇(DTT)对该酶有较强的激活作用,而Cu2+和Zn2+则有较强的抑制作用。该酶可耐受高浓度NaCl,对低浓度乙醇也有一定的耐受性,对于酱油中氨基甲酸乙酯的消除有一定的参考意义。 展开更多

关键词 氨基甲酸乙酯 氨基甲酸乙酯水解酶 耐盐 分离纯化 酶学性质

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定点突变改造提高纺锤形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶稳定性 被引量：9

4

作者 刘晓慧 方芳 +2 位作者 夏小乐 堵国成 陈坚 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1233-1242,共10页

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种存在于发酵食品和酿造酒精饮料中的潜在致癌物质。利用生物酶法去除食品饮料中的EC是一种较为安全有效的方法。本研究以来源于赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02的氨基甲酸乙酯水解... 氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种存在于发酵食品和酿造酒精饮料中的潜在致癌物质。利用生物酶法去除食品饮料中的EC是一种较为安全有效的方法。本研究以来源于赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02的氨基甲酸乙酯水解酶为研究对象,采用计算机辅助设计突变位点,构建了其不稳定区域Q328位点的饱和突变体。通过酶学性质分析发现,突变体Q328C和Q328V在40℃下的半衰期分别提高了7.46和1.99倍,Q328R在高温下也有比原酶更好的耐受性。此外,突变体Q328C对乙醇的耐受性和酸耐受性也有所提高。对氨基甲酸乙酯水解酶分子改造的结果表明,通过改造其不稳定区域Q328位点,可以提高酶的热稳定性及对酸和乙醇的耐受性。 展开更多

关键词 定点突变 氨基甲酸乙酯水解酶 氨基甲酸乙酯 酶稳定性

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赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯水解酶的发酵条件优化 被引量：8

5

作者 王伟高 陈坚 周景文 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期259-265,共7页

氨基甲酸乙酯是发酵酒精饮料及发酵食品中一种广泛存在的致癌物,酶法降解是解决氨基甲酸乙酯污染的重要途径之一。作者以一株来源于小鼠胃部具有水解氨基甲酸乙酯活性的菌株Lysinibacillus fusiformis SC02为出发菌株,通过摇瓶水平单因... 氨基甲酸乙酯是发酵酒精饮料及发酵食品中一种广泛存在的致癌物,酶法降解是解决氨基甲酸乙酯污染的重要途径之一。作者以一株来源于小鼠胃部具有水解氨基甲酸乙酯活性的菌株Lysinibacillus fusiformis SC02为出发菌株,通过摇瓶水平单因素实验对其产酶条件进行了优化。优化后的培养基组成为:半乳糖25 g/L,大豆蛋白胨20 g/L,尿素4 g/L,硫酸铜0.02 g/L,pH6.0。最佳产酶的发酵条件为:发酵温度37℃,接种体积分数3%,装液量20 m L/250 m L。在上述优化的培养基和培养条件下,产酶水平由900 U/L提高到4 500 U/L,提高了350%。在3 L发酵罐水平上初步探究了不同搅拌转速对菌株产酶的影响。当搅拌转速达到800 r/min,菌株最高酶活水平由4 500 U/L提高到7 066 U/L,提高了57%。 展开更多

关键词 氨基甲酸乙酯水解酶 发酵条件优化 芽孢杆菌 发酵食品

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酶法降解氨基甲酸乙酯及其在白酒中的应用研究进展 被引量：2

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作者 梁鑫 张成楠 李秀婷 《中国酿造》 CAS 北大核心 2023年第7期1-6,共6页

白酒的酿造过程会产生氨基甲酸乙酯(EC),这种致癌物的存在严重影响其食品安全性,如何有效消减白酒中的EC成为了研究热点。酸性脲酶及EC水解酶可降解EC及前体物尿素,具有直接、高效的特点,因此酶法降解成为控制白酒EC含量的最有效方法之... 白酒的酿造过程会产生氨基甲酸乙酯(EC),这种致癌物的存在严重影响其食品安全性,如何有效消减白酒中的EC成为了研究热点。酸性脲酶及EC水解酶可降解EC及前体物尿素,具有直接、高效的特点,因此酶法降解成为控制白酒EC含量的最有效方法之一。该研究从酸性脲酶和EC水解酶研究现状、白酒的EC现状分析、白酒中EC的形成机制及酶法降解消减EC在白酒中的应用等方面进行综述,同时,对酸性脲酶和EC水解酶酶产量低、需镍离子(Ni^(2+))作为辅助因子而带来的食品安全问题,提出通过异源表达、底物特异性改造EC水解酶和酸性脲酶等策略以提高酶产量及催化效率,为提高白酒安全性提供重要的理论和实践参考。 展开更多

关键词 白酒 氨基甲酸乙酯 酸性脲酶 氨基甲酸乙酯水解酶

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氨基甲酸乙酯水解酶可溶性表达及其酶学性质研究

7

作者 刘凤松 李亚杰 +2 位作者 李亚贤 龙梦飞 陆智 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期59-66,共8页

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)是一种主要存在于发酵食品和酒精饮料中对人体有潜在致癌性的有害物质,EC水解酶能够有效地消减EC,但其存在异源表达量较低、乙醇耐受性较差等问题。该研究结合计算机辅助改造与基于机器学习的融合标签... 氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)是一种主要存在于发酵食品和酒精饮料中对人体有潜在致癌性的有害物质,EC水解酶能够有效地消减EC,但其存在异源表达量较低、乙醇耐受性较差等问题。该研究结合计算机辅助改造与基于机器学习的融合标签设计等手段对赖氨酸芽孢杆菌来源的EC水解酶进行改造及优化。首先利用PROSS计算程序改造EC水解酶提高其乙醇耐受性,其次基于支持向量机回归的机器学习模型设计促溶标签提高其可溶性表达。基于PROSS筛选获得了组合突变体S21E/H197Y/Q328C/P348I(EC4),其酶活力相较于野生型提高了1.55倍,20%(体积分数)乙醇条件下的相对酶活力较野生型提高了约2.56倍。进一步筛选了合适的短促溶标签获得可溶性表达提高最多的是SVM1-EC4,其酶活力约为野生型的1.82倍,15%(体积分数)乙醇下的相对酶活力是野生型的3.99倍,且在模拟酒样中水解EC效果是野生型的2.07倍。总之,计算与融合标签相结合对EC水解酶进行改造能够有效地提高其可溶性表达及乙醇耐受性,为其工业应用提供了一定的理论依据和技术基础。 展开更多

关键词 氨基甲酸乙酯水解酶 可溶性表达 乙醇耐受性 融合标签 PROSS计算 机器学习

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氨基甲酸乙酯水解酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化 被引量：5

8

作者 吕思熠 方芳 +1 位作者 堵国成 陈坚 《过程工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期846-852,共7页

将来源于赖氨酸芽孢杆菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶(UH)基因在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中进行克隆和表达,在枯草芽孢杆菌中实现了UH活性表达,在摇瓶水平通过单因素考察和响应面分析实验对氨基甲酸乙酯水解酶发酵进行优化.结... 将来源于赖氨酸芽孢杆菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶(UH)基因在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中进行克隆和表达,在枯草芽孢杆菌中实现了UH活性表达,在摇瓶水平通过单因素考察和响应面分析实验对氨基甲酸乙酯水解酶发酵进行优化.结表明,酶活最高可达到14.20 U/mL,产酶最佳培养基成分为:淀粉10 g/L、磷酸氢二钾9 g/L、麦芽浸膏25 g/L、硫酸镁1 g/L、胰蛋白胨55 g/L,最适发酵温度为37℃,最佳接种量4%.在3 L发酵罐中采用最优发酵条件,酶活在16 h达到18.03 U/mL. 展开更多

关键词 氨基甲酸乙酯水解酶 枯草芽孢杆菌 培养基 发酵 响应面

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氨基甲酸乙酯水解酶的家族生物信息学分析 被引量：2

9

作者 张献 彭涛 +2 位作者 张耀 李若熙 杨丽娟 《生物信息学》 2022年第1期64-74,共11页

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)是酒精饮料生产过程中自然产生的副产物,具有潜在的致癌性和遗传毒性,成为影响人们健康的隐患。利用氨基甲酸乙酯水解酶(Urethane hydrolase, UH)消除酒精饮料中已存在的EC具有直接、高效的作用。为... 氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)是酒精饮料生产过程中自然产生的副产物,具有潜在的致癌性和遗传毒性,成为影响人们健康的隐患。利用氨基甲酸乙酯水解酶(Urethane hydrolase, UH)消除酒精饮料中已存在的EC具有直接、高效的作用。为了进一步探索EC水解酶的功能与作用,本实验利用生物信息学的方法对已注释的EC水解酶进行其氨基酸序列的理化性质、亲疏水性、信号肽、跨膜结构域、蛋白质的二级、三级结构及功能域进行预测分析,并将EC水解酶蛋白进行多序列比对分析。结果表明,EC水解酶基因编码472~551 aa,分子量在50~62 kD之间,理论等电点(pI)在5左右,均为酸性亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构预测结果显示EC水解酶的氨基酸都以α螺旋以及无规则卷曲为主,螺旋与折叠排列有序。此外,使用同源建模的方法对EC水解酶进行模型的构建,预测结果质量评估均较好,并使用同源比对的方法,分析出EC水解酶高保守氨基酸残基。这些分析与预测为挖掘新的EC水解酶、进一步研究EC与EC水解酶结合位点以及对EC水解酶的改造提供了理论依据。 展开更多

关键词 氨基甲酸乙酯 氨基甲酸乙酯水解酶 生物信息学 结构预测

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假丝酵母氨基甲酸乙酯水解酶的分子克隆及酶学性质 被引量：2

10

作者 张献 冯治平 +2 位作者 张耀 张雪怡 杨丽娟 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期56-62,共7页

氨基甲酸乙酯是存在于发酵食品中的一种潜在致癌物。生物酶法可有效降解氨基甲酸乙酯。该研究从假丝酵母CCTCC AY 2017001基因组中克隆了氨基甲酸乙酯水解酶基因cpUH,并实现了其在Escherichia coli中的高效表达。实验结果表明,cpUH基因... 氨基甲酸乙酯是存在于发酵食品中的一种潜在致癌物。生物酶法可有效降解氨基甲酸乙酯。该研究从假丝酵母CCTCC AY 2017001基因组中克隆了氨基甲酸乙酯水解酶基因cpUH,并实现了其在Escherichia coli中的高效表达。实验结果表明,cpUH基因大小为1656 bp,编码552个氨基酸;重组蛋白大小约为60 kDa,纯化后比酶活力为3.10 U/mg;cpUH的最适反应温度和pH分别为40℃和7.5,其在25~30℃和pH 6.0~9.0均有较好的稳定性;金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)明显抑制酶活力,其余Fe^(3+)、Mn^(2+)、Ca^(2+)、Co^(2+)、Mg^(2+)都对酶活力有抑制作用,而EDTA对酶活力无影响;此外,以氨基甲酸乙酯为底物时,其K_(m)和V_(max)值分别为6.01 mmol/L和3.34μmol/min,且cpUH对乙醇具有一定的耐受性,有望应用到酒饮料生产中。 展开更多

关键词 假丝酵母 氨基甲酸乙酯 氨基甲酸乙酯水解酶 异源表达 酶学性质

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氨基甲酸乙酯水解酶异源表达及酶学性质分析

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作者 高孝 高洁 +3 位作者 刘晓宇 王中选 刘庆涛 桑亚新 《食品研究与开发》 CAS 北大核心 2022年第10期195-201,共7页

将合成的来源于长孢洛德酵母菌(Lodderomyces elongisporus)属的氨基甲酸乙酯水解酶基因在大肠杆菌中实现异源表达,并进行纯化及其酶学性质研究。摇床培养后酶的比活力为4.52 U/mg,经过镍离子亲和层析柱纯化至显示单一条带后酶的比活力... 将合成的来源于长孢洛德酵母菌(Lodderomyces elongisporus)属的氨基甲酸乙酯水解酶基因在大肠杆菌中实现异源表达,并进行纯化及其酶学性质研究。摇床培养后酶的比活力为4.52 U/mg,经过镍离子亲和层析柱纯化至显示单一条带后酶的比活力为9.86 U/mg。酶学性质研究表明,氨基甲酸乙酯水解酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为7.0;金属离子Mg^(2+)对该水解酶的酶活有微弱的促进作用,而Cu^(2+)以及Fe^(3+)对酶的活性有强烈的抑制作用;对低含量的乙醇溶液与NaCl溶液有一定的耐受性;并且该水解酶可以对不同底物的酰胺类化合物进行有效降解,以氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)为底物进行反应时测得水解酶的动力学参数K_(m)值为6.64 mmol/L,最大反应速率V_(max)值为8.24μmol/min。 展开更多

关键词 氨基甲酸乙酯 氨基甲酸乙酯水解酶 异源表达 酶学性质 长孢洛德酵母菌

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氨基甲酸乙酯降解菌株的筛选鉴定与发酵产酶优化

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作者 杨攀平 丁炎 +5 位作者 仲梦园 李锐 吕璨 徐江南 孙恬晋 卢河东 《中国调味品》 CAS 北大核心 2022年第4期82-87,共6页

该实验旨在从酒曲中分离一株降解氨基甲酸乙酯的功能菌株并对其产酶条件进行优化。通过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。通过单因素实验结合正交实验对该菌株进行产酶条件探索,最适产酶条件为:蔗糖25 g/L,... 该实验旨在从酒曲中分离一株降解氨基甲酸乙酯的功能菌株并对其产酶条件进行优化。通过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。通过单因素实验结合正交实验对该菌株进行产酶条件探索,最适产酶条件为:蔗糖25 g/L,蛋白胨12.5 g/L,硫酸镁0.075 g/L,氯化钠5 g/L,pH 6.0,温度33℃,接种量3%,转速180 r/min,其最佳酶活性为4477 U/L,是优化前的5.45倍。该研究为生物法降解氨基甲酸乙酯提供了新的功能菌株,并在酿造类调味品和发酵饮品的生产中。 展开更多

关键词 氨基甲酸乙酯水解酶 解淀粉芽孢杆菌 调味品 发酵条件优化 食品安全

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