雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质研究 被引量：7

1

作者 王建荣 刘丹妮 +6 位作者 李鹏 刘金山 周平发 陈丽芝 聂金梅 钟开兴 李阳源 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期83-88,共6页

采用同源克隆法获得了雪白根霉的脂肪酶基因(rnl),将其连接到pPICZαA载体上,得到重组表达载体pPICZαA-rnl。将表达载体pPICZαA-rnl用限制性内切酶SacI线性化后,电击转入毕赤酵母X-33中。雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母X-33中成功表达... 采用同源克隆法获得了雪白根霉的脂肪酶基因(rnl),将其连接到pPICZαA载体上,得到重组表达载体pPICZαA-rnl。将表达载体pPICZαA-rnl用限制性内切酶SacI线性化后,电击转入毕赤酵母X-33中。雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母X-33中成功表达,重组菌株摇瓶培养144 h后,酶活可达48 U/mL。重组酶最适pH值为8.5,最适反应温度为35℃。1 mmol/L的Mn2+,Ca2+和K+以及1%的表面活性剂吐温20,吐温80,曲通100对重组脂肪酶具有激活作用。重组酶的最适底物为三月桂酸甘油酯(C12)。 展开更多

关键词 雪白根霉 脂肪酶 毕赤酵母x-33

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毕赤酵母X-33OCH1基因敲除菌株的构建及其表达低糖基化蛋白GM-CSF 被引量：3

2

作者 张大成 许永利 +2 位作者 辛鑫 朱瑞宇 金坚 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期622-629,共8页

【目的】酵母表达外源糖蛋白时会对蛋白进行过度N-糖基化修饰,产生高甘露糖型糖链,影响蛋白的活性,其中α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)在这一过程中起着关键作用。通过敲除毕赤酵母X-33的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得一个对糖蛋白... 【目的】酵母表达外源糖蛋白时会对蛋白进行过度N-糖基化修饰,产生高甘露糖型糖链,影响蛋白的活性,其中α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)在这一过程中起着关键作用。通过敲除毕赤酵母X-33的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统。【方法】采用双交换同源重组敲除目的基因的方法,首先敲除毕赤酵母X-33的URA3基因,获得一个尿嘧啶营养缺陷型的X-33(ura3-)菌株;然后用URA3基因作为选择标记,敲除X-33(ura3-)的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得OCH1基因敲除的X-33(och1-)菌株。用X-33(och1-)菌表达糖蛋白GM-CSF,分析GM-CSF蛋白糖链的变化。【结果】首次成功敲除了X-33的URA3和OCH1基因,与野生型相比,X-33(och1-)菌表达的GM-CSF蛋白过度糖基化修饰程度明显降低。【结论】X-33(och1-)菌株的构建提供了一个对蛋白低N-糖基化修饰的毕赤酵母表达系统,也为进一步的糖基化改造提供了良好的基础。 展开更多

关键词 N-糖基化 毕赤酵母x-33 基因敲除 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)

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番鸭细小病毒VP2基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的鉴定 被引量：3

3

作者 娄华 白挨泉 +3 位作者 顾万军 陆英杰 贺东升 刘福安 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期202-206,共5页

通过DNA重组技术,将克隆到的MDPV＿Q和MDPV＿26的VP2基因片段,经两种限制性核酸内切酶SacII和Kp nI的酶切,将酶切产物再克隆到表达载体pPICZαA中,得到表达重组质粒pPICZαA＿M＿QVP2和pPICZαA＿M＿26VP2。将这两种表达重组质粒分别转... 通过DNA重组技术,将克隆到的MDPV＿Q和MDPV＿26的VP2基因片段,经两种限制性核酸内切酶SacII和Kp nI的酶切,将酶切产物再克隆到表达载体pPICZαA中,得到表达重组质粒pPICZαA＿M＿QVP2和pPICZαA＿M＿26VP2。将这两种表达重组质粒分别转化到毕赤酵母(PichiaPastorisX＿33)中进行表达,经甲醇诱导和SDS＿PAGE分析结果表明,MDPV＿QVP2和MDPV＿26VP2基因片段的表达产物大小约为73kD,与理论预计相符。此外,本研究还意外地发现,重组质粒转化到酵母菌进行表达,在表达VP2结构蛋白的同时,还表达了一条大小约为60kD的蛋白条带。 展开更多

关键词 番鸭细小病毒 毕赤酵母x-33 表达 VP2基因

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毕赤酵母X-33糖基化突变菌株的生理特性 被引量：2

4

作者 许永利 张大成 +2 位作者 朱瑞宇 陈蕴 金坚 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第4期439-442,共4页

目的研究毕赤酵母X-33野生型菌株(wX-33)和X-33α-1,6甘露糖基转移酶(Och1p)突变株(och1 mX-33)的生理特性,为och1mX-33株进一步糖基化的研究奠定基础。方法绘制wX-33和och1 mX-33菌株的生长曲线,进行温度敏感性及刚果红敏感性试验,美... 目的研究毕赤酵母X-33野生型菌株(wX-33)和X-33α-1,6甘露糖基转移酶(Och1p)突变株(och1 mX-33)的生理特性,为och1mX-33株进一步糖基化的研究奠定基础。方法绘制wX-33和och1 mX-33菌株的生长曲线,进行温度敏感性及刚果红敏感性试验,美蓝染色观察其形态变化,并检测细胞的存活率。结果与wX-33株比较,och1 mX-33株生长缓慢,生物量减少;对温度、刚果红敏感性增强;存在细胞壁分裂缺陷;在不适温度下,细胞存活率降低。结论糖基化突变可影响毕赤酵母X-33对温度、刚果红的敏感性,使其细胞壁层甘露糖含量降低,并可使och1 mX-33株的生理特性发生很大变化。 展开更多

关键词 毕赤酵母x-33 och1突变 糖基化 生长表型

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β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达 被引量：2

5

作者 陈龙军 陈济琛 +2 位作者 陈亚兰 林戎斌 林新坚 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期170-174,共5页

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中。本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵... β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中。本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经SacI线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku。β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃。 展开更多

关键词 毕赤酵母x-33 β-1 3-1 4-葡聚糖酶 诱导

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BPI_(23)-haFGF融合蛋白在毕赤酵母X-33中的分泌表达及活性鉴定 被引量：1

6

作者 马艳 朱家勇 +2 位作者 金小宝 彭海英 王艳 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 北大核心 2009年第2期379-384,共6页

将BPI23-haFGF融合基因克隆到酵母表达载体pPICZαA中,构建出含BPI23-haFGF融合基因的重组质粒pPICZαA-BPI23-haFGF。通过电击将经SacⅠ酶切线性化的pPICZαA-BPI23-haFGF质粒转化到巴斯德毕赤酵母X-33菌中,并通过抗性与表型筛选、PCR... 将BPI23-haFGF融合基因克隆到酵母表达载体pPICZαA中,构建出含BPI23-haFGF融合基因的重组质粒pPICZαA-BPI23-haFGF。通过电击将经SacⅠ酶切线性化的pPICZαA-BPI23-haFGF质粒转化到巴斯德毕赤酵母X-33菌中,并通过抗性与表型筛选、PCR鉴定获得高效的工程菌。收集表达上清进行SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明,在43KD有与预期大小相符的条带,占上清总蛋白的50%以上。亲和层析纯化后的融合蛋白BPI23-haFGF纯度约90%,体外活性实验结果,纯化产物具有杀死革兰氏阴性菌及促进NIH3T3细胞增殖的双重功能。 展开更多

关键词 BPI23-haFGF融合基因 毕赤酵母x-33 分泌表达 活性鉴定

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指状青霉cyt b_5和cyt b_5r基因克隆及与cyp51A的共表达

7

作者 秦婷婷 耿辉 +3 位作者 王胜强 牛玉慧 伍志 刘德立 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期179-188,共10页

为探究指状青霉细胞色素b5(Cyt b5)与细胞色素b5还原酶(Cyt b5r)在细胞色素P450 CYP51A电子传递方面的功用,研究了指状青霉CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达机制;并检测了其对于cyp51A基因表达水平的影响。通过转录组分析筛选并PCR克隆获得... 为探究指状青霉细胞色素b5(Cyt b5)与细胞色素b5还原酶(Cyt b5r)在细胞色素P450 CYP51A电子传递方面的功用,研究了指状青霉CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达机制;并检测了其对于cyp51A基因表达水平的影响。通过转录组分析筛选并PCR克隆获得了cyt b5与cyt b5r基因,分别命名为HS-Pdcyt b5和HS-Pdcyt b5r。以多基因串联克隆载体p PICZαA为骨架构建了指状青霉共表达质粒ppbr A(p PIC-Pdcyp51A-cyt b5-cyt b5r);电转化法将重组质粒ppbr A导入毕赤酵母X-33中。q RT-PCR分析结果显示,CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达后,其基因表达水平升高54%-97%,并维持较长时间(48-72 h)。表明Cyt b5-Cyt b5r系统可将电子高效转移给CYP51A,从而增强cyp51A基因的转录表达。从指状青霉中克隆表达HS-Pd Cyt b5和HS-Pd Cyt b5r蛋白,并通过共表达的方式研究cyp51A基因的功能尚为首次报道。 展开更多

关键词 指状青霉CYP51A 共表达 细胞色素B5 细胞色素b5还原酶 毕赤酵母x-33

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油橄榄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 被引量：3

8

作者 陈文拴 黄乾明 +3 位作者 陈华萍 杨泽身 王安逸 苏光灿 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第7期124-130,共7页

采用同源克隆、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、融合引物嵌套PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)与3’-c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RA... 采用同源克隆、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、融合引物嵌套PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)与3’-c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术相结合,从油橄榄(Olea europaea)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)基因全长,命名为Oe PAL。序列分析表明,Oe PAL的DNA全长2 970 bp(Gen Bank登录号KJ511867),含一个内含子(393~1 220 bp);全长c DNA有2 142 bp(Gen Bank登录号KJ511868),开放阅读框编码713个氨基酸,与其他植物有较高的同源性。利用该基因构建重组质粒p PICZαA-Oe PAL,且在毕赤酵母X33中进行诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)检测显示该重组酶的分子质量在77.5 k D左右,纯化后的酶比活力为196.3 U/mg。酶学性质研究表明:该重组酶的最适反应条件为40℃,p H 8.8;在供试范围内Cu2+与Na+可以提高该酶活性;以L-苯丙氨酸为底物,在最适条件下该酶的Km为4.89×10-4 mol/L。结果表明成功地克隆到Oe PAL,构建了表达载体,并进行了功能验证。 展开更多

关键词 苯丙氨酸解氨酶 基因克隆 表达载体 毕赤酵母x33

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重组猪胰蛋白酶原及其突变体在毕赤酵母X33中的组成型表达 被引量：2

9

作者 窦俊 方宏清 +6 位作者 徐登圆 赵珊珊 陈慧梅 徐晓峰 支艳艳 李晓稳 文良柱 《生物技术通讯》 CAS 2020年第5期511-516,560,共7页

目的:设计以PGAP为启动子的组成型质粒,构建高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得重组猪胰蛋白酶。方法:首先将质粒转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,电转化至毕赤酵母X33,表达重组猪胰蛋白酶原,经肠激酶激活,纯化提取得到重组猪... 目的:设计以PGAP为启动子的组成型质粒,构建高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得重组猪胰蛋白酶。方法:首先将质粒转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,电转化至毕赤酵母X33,表达重组猪胰蛋白酶原,经肠激酶激活,纯化提取得到重组猪胰蛋白酶。结果:筛选到高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得了重组猪胰蛋白酶。结论:以PGAP为启动子的质粒,转化毕赤酵母X33后表达的重组猪胰蛋白酶原避免了补加甲醇带来的危害,且操作方便,大大缩短了周期,提高了生产效率,避免了动物源性污染。 展开更多

关键词 毕赤酵母x33 重组猪胰蛋白酶原 重组猪胰蛋白酶 酵母表达

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人源极光激酶A在毕赤酵母和MCF-7细胞中的表达及纯化 被引量：1

10

作者 于洋 于丽娜 +3 位作者 谢萍 王福启 麻薇 施维 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期266-270,共5页

目的:构建人源极光激酶A(AURKA)真核表达载体,检测其在毕赤酵母X33和MCF-7细胞中的表达及纯化。方法:将双酶切PCR扩增的目的基因与真核表达载体连接,构建重组质粒。电转法转染重组质粒,筛选后采用SDS-PAGE和Western blotting法检测AURK... 目的:构建人源极光激酶A(AURKA)真核表达载体,检测其在毕赤酵母X33和MCF-7细胞中的表达及纯化。方法:将双酶切PCR扩增的目的基因与真核表达载体连接,构建重组质粒。电转法转染重组质粒,筛选后采用SDS-PAGE和Western blotting法检测AURKA蛋白的表达,Ni-NTA柱法纯化表达的蛋白;放射自显影法检测AURKA的生物活性;细胞计数法检测转染重组质粒后MCF-7细胞增殖情况。结果:2种重组质粒经PCR均扩增出1 212bp目的基因,表明真核表达载体构建成功。重组AURKA蛋白相对分子质量约为50 000,且可磷酸化其底物组蛋白H3,表明重组AURKA具有活性。与转染空质粒和野生型MCF-7细胞比较,转染AURKA 24和48h后MCF-7活细胞数量明显增加。结论:AURKA在毕赤酵母和MCF-7细胞中成功表达和纯化,且其过表达可促进细胞增殖。 展开更多

关键词 人源激光激酶A 毕赤酵母x33 MCF-7细胞 细胞增殖

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两种葡萄糖氧化酶基因分别在酿酒酵母及毕赤酵母中的重组表达

11

作者 龚映雪 张楚秋 +2 位作者 林蒋海 肖文娟 刘泽寰 《兰州大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期237-241,247,共6页

从Aspergillus niger CICC 40179中克隆得到了葡萄糖氧化酶(GOD)基因,并在酿酒酵母AS2.489中通过载体p2μRCMB进行重组表达.合成来源于A.niger的一段GOD基因(美国专利号为5094951),同时对其进行了少量密码子的同义替换以避免部分酶切位... 从Aspergillus niger CICC 40179中克隆得到了葡萄糖氧化酶(GOD)基因,并在酿酒酵母AS2.489中通过载体p2μRCMB进行重组表达.合成来源于A.niger的一段GOD基因(美国专利号为5094951),同时对其进行了少量密码子的同义替换以避免部分酶切位点,将该段合成的序列通过甲醇诱导型载体p PICZαA在毕赤酵母X33中进行了重组表达.比较分析两种葡萄糖氧化酶的分泌表达情况. 展开更多

关键词 P PICZαA–GOD p2μRCMB–GOD 毕赤酵母x33 酿酒酵母AS2.489

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