人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达 被引量：40

1

作者 贝锦龙 陈庄 +3 位作者 杨林 廖玲 王珣章 蒋宗勇 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期254-258,共5页

本文以黑曲霉 (Aspergillusniger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象 ,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列 ,换用在毕赤酵母 (Pichiapastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因 (PhyA as... 本文以黑曲霉 (Aspergillusniger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象 ,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列 ,换用在毕赤酵母 (Pichiapastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因 (PhyA as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDS PAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达 ,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌 ,其中SPAN Ⅲ菌株达到了在摇床培养条件下 ,每毫升发酵液产生 16 5 0 0 0u植酸酶的水平 。 展开更多

关键词 基因人工合成 植酸酶基因 phyA-as 毕赤酵母表达系统

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抗菌肽牛乳铁多肽素(LfcinB)在毕赤酵母中的表达及活性鉴定 被引量：15

2

作者 易俊波 黄德新 +1 位作者 李凌云 林枫 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期265-269,共5页

利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)系统表达抗菌肽——牛乳铁多肽素(bovine lactoferricin,简称Lf-cinB),获得的分泌型表达产物具有较强的抗菌活性。首先将人工合成的LfcinB基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得... 利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)系统表达抗菌肽——牛乳铁多肽素(bovine lactoferricin,简称Lf-cinB),获得的分泌型表达产物具有较强的抗菌活性。首先将人工合成的LfcinB基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinB通过限制性内切酶SalⅠ酶切线性化,经电穿孔法转化入毕赤酵母细胞SMD1168内。G418抗性筛选,得到高拷贝转化子,经PCR检测LfcinB基因与毕赤酵母染色体稳定整合。阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinB。结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽素基因已经整合到酵母细胞基因组中并获得表达,表达产物具有较强的杀菌作用。 展开更多

关键词 牛乳铁多肽素(LfcinB) 基因 表达载体 毕赤酵母表达系统

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乙型肝炎病毒核心基因在毕赤酵母中的表达及表达产物在乙型肝炎病毒核心抗体检测中的应用评价 被引量：12

3

作者 梁敏坚 洪国强 +3 位作者 李朝霞 胡波 许珏 李林 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期417-422,共6页

目的在毕赤酵母中表达出高免疫反应性和特异性的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),探讨该表达产物在乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)免疫检测中的应用。方法用PCR从含有乙型肝炎病毒DNA模板的质粒中扩增出编码HBcAg的C基因,插入pPIC9酵母... 目的在毕赤酵母中表达出高免疫反应性和特异性的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),探讨该表达产物在乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)免疫检测中的应用。方法用PCR从含有乙型肝炎病毒DNA模板的质粒中扩增出编码HBcAg的C基因,插入pPIC9酵母表达载体。携带有C片段的pPIC9转化毕赤酵母菌株GS115,经甲醇诱导表达HBcAg。分别用分子筛纯化毕赤酵母表达的HBcAg(A)、单克隆HBcAb特异结合纯化毕赤表达的HBcAg(B)、分子筛纯化大肠杆菌表达的HBcAg(C)、单克隆HBcAb特异结合纯化大肠杆菌表达的HBcAg(D)作为固相抗原,辣根过氧化物酶标记多克隆HBcAb为探测抗体,用竞争抑制法酶联免疫吸附测定(competitiveinhibitionELISA)检测HBcAb标准品及含有乙型肝炎病毒PCR阳性和阴性血清的临床标本。结果聚丙烯酰胺凝胶电泳、immunoblot、ELISA显示HBcAg在毕赤酵母中高效表达;分别用抗原A、B、C、D制备的试剂检测中国药品生物制品检定所HBcAb国家参考品:试剂A与B结果相同:阴性符合率(-/-)15/15,阳性符合率(+/+)15/15;最低检出量(稀释度):灵敏度参考品2#=1∶128,3#=1∶16,4#=1∶64。试剂C与D结果相同:阴性符合率(-/-)15/15;阳性符合率(+/+)14/15;最低检出量(稀释度):灵敏度参考品2#=1∶32;3#=1∶16;4#=1∶32;大肠杆菌抗原的灵敏度明显低于毕赤酵母抗原。对乙型肝炎病毒PCR阳性及阴性的临床标本进行检测,结果如下:PCR阳性组HBcAb阳性检出率:试剂A97.8%;试剂B98.1%;试剂C96.6%;试剂D91.4%;A、B、C三组间比较差异无统计学意义(P>0.05);D分别与A、B、C相比较差异均有统计学意义(P<0.005)。PCR阴性组HBcAb阴性检出率:试剂A80.3%;试剂B80.9%;试剂C75.0%;试剂D85.7%;AB两组比较差异无统计学意义(P>0.05);AC、AD、BC,BD、CD相比较差异均有统计学意义(P<0.005);分子筛纯化的大肠杆菌HBcAg含有干扰检测的杂质,结果出现假阳性;大肠杆菌HBcAg存在表位缺失导致结果� 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒核心基因 表达产物 应用评价 抗体检测 中国药品生物制品检定所 乙型肝炎病毒核心抗原 表达及 聚丙烯酰胺凝胶电泳 HBCAB HBcAg 酶联免疫吸附测定 毕赤酵母表达系统 大肠杆菌表达 免疫反应性 阳性符合率 最低检出量

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α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用 被引量：10

4

作者 孟鹏 齐西珍 +3 位作者 郑芳 任丽梅 白芳 白钢 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1080-1086,共7页

【目的】针对人α-麦芽糖苷酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人α-麦芽糖苷酶。利用酶的催化特性建立α-糖苷酶抑制剂筛选模型。应用该模型对放线菌代谢产... 【目的】针对人α-麦芽糖苷酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人α-麦芽糖苷酶。利用酶的催化特性建立α-糖苷酶抑制剂筛选模型。应用该模型对放线菌代谢产物库进行高通量筛选。通过构建16SrRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】首次成功克隆、表达了具催化活性的人α-麦芽糖苷酶N端结构域。针对人α-麦芽糖苷酶N端催化结构域,建立α-糖苷酶抑制剂的筛选模型。对包含近2000株放线菌代谢产物的天然产物库进行高通量筛选,最终得到20株α-麦芽糖苷酶抑制剂生产菌株。其中19株放线菌为链霉菌属,且在分类学上具有丰富的多样性。【结论】本研究建立的α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型糖苷酶抑制剂类降糖药物的开发。 展开更多

关键词 Α-糖苷酶抑制剂 毕赤酵母表达系统 α-麦芽糖苷酶 放线菌 高通量药筛

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风疹病毒JR23株糖蛋白E1在毕赤酵母表达系统中的表达和抗原性分析 被引量：5

5

作者 温红玲 王志玉 +5 位作者 宋艳艳 任桂杰 陶泽新 宋绍霞 王桂亭 许洪芝 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期190-193,共4页

目的　在毕赤酵母表达系统中表达风疹病毒 (rubellavirus ,RV)JR2 3株包膜糖蛋白E1 ,为研究E1蛋白的结构功能、开发基因工程疫苗和重组蛋白诊断试剂盒奠定基础。方法　E1基因的表达质粒 pGAPZαA E1经AvrⅡ线性化后用LiCl法转化酵母菌 ,... 目的　在毕赤酵母表达系统中表达风疹病毒 (rubellavirus ,RV)JR2 3株包膜糖蛋白E1 ,为研究E1蛋白的结构功能、开发基因工程疫苗和重组蛋白诊断试剂盒奠定基础。方法　E1基因的表达质粒 pGAPZαA E1经AvrⅡ线性化后用LiCl法转化酵母菌 ,在YPD(含 1 0 0 μg/mlZeocinTM)平板上两次筛选 ,挑出单菌落 ,于液体YPD中培养 ,并在不同时间收集培养物 ,用SDS PAGE和Westernblot进行分析。结果　SDS PAGE显示E1重组蛋白在毕赤酵母中高效稳定表达 ,在 4 8h时表达量达到最高 ,之后趋于稳定 ,上清和细胞中均有蛋白表达。Westernblot结果表明 ,上清中的E1重组蛋白能够分别与抗RV的阳性血清和单克隆抗体反应 ,而细胞中的E1重组蛋白只能与抗RV的阳性血清反应 ,不能与单克隆抗体反应。这说明所表达的蛋白一部分在信号肽的引导下分泌出胞 ,并经过折叠形成了正确的构像 ,能够与单克隆抗体结合 ;而另一部分由于蛋白本身的跨膜区连在了细胞膜上没有分泌出去 ,没有形成能够被单抗识别的构像 ,不能与单抗结合。结论　E1包膜糖蛋白在酵母菌中成功表达 ,且免疫反应性良好。 展开更多

关键词 毕赤酵母表达系统 JR23株 风疹病毒 抗原性分析 SDS-PAGE Western 包膜糖蛋白E1 E1包膜糖蛋白 重组蛋白 基因工程疫苗 blot 抗体反应 诊断试剂盒 单克隆抗体 免疫反应性 结构功能 E1蛋白 LICL 表达质粒 E1基因 不同时间

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外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略 被引量：8

6

作者 孙玮遥 王向东 林剑 《中国酿造》 CAS 北大核心 2016年第9期11-15,共5页

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论... 毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论和现实意义。该文从发酵工艺方面对影响外源蛋白表达的各种因素做了具体阐述,主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制,旨在提高外源蛋白表达量。 展开更多

关键词 毕赤酵母表达系统 外源蛋白 发酵工艺 优化

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β_2肾上腺素受体基因在毕赤酵母中的表达及活性测定 被引量：6

7

作者 黄园园 沈红 +4 位作者 王迪 于洪侠 孙丰梅 杨啸枫 杨曙明 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期18-22,共5页

为提高β2-肾上腺素受体(β2AR)表达量,满足生产需求,使其应用到抗体技术上,利用分子克隆技术将β2-肾上腺素受体基因(β2AR)与绿色荧光蛋白基因(eGFP)克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体中。表达载体pPICZαDNAsGFP转化至酵母后,... 为提高β2-肾上腺素受体(β2AR)表达量,满足生产需求,使其应用到抗体技术上,利用分子克隆技术将β2-肾上腺素受体基因(β2AR)与绿色荧光蛋白基因(eGFP)克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体中。表达载体pPICZαDNAsGFP转化至酵母后,β2AR和eGFP基因与酵母基因重组。利用筛选出的阳性重组子诱导表达β2AR和eGFP的融合蛋白,通过125I标记的配体结合实验证明获得了有受体活性的融合蛋白。 展开更多

关键词 Β2肾上腺素受体 EGFP 毕赤酵母表达系统 pPICZαA Β2激动剂

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巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 被引量：5

8

作者 张树军 杨磊 黄瑾 《农垦医学》 2007年第3期231-233,共3页

关键词 毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母 真核生物 外源蛋白 高密度发酵 细胞内环境 原核生物 基因工程

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牛乳铁蛋白多肽的合成及抗菌活性试验 被引量：5

9

作者 史芳芳 王亮 +1 位作者 吕自力 王安江 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期20-23,共4页

用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽LfcinB基因片段。合成片段与酵母表达载体pPICZαA重组,构建胞外分泌表达载体pPICZαA-LfcinB,通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母X-33宿主菌,Zeocin抗性筛选,经PCR检... 用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽LfcinB基因片段。合成片段与酵母表达载体pPICZαA重组,构建胞外分泌表达载体pPICZαA-LfcinB,通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母X-33宿主菌,Zeocin抗性筛选,经PCR检测LfcinB基因与毕赤酵母染色体稳定整合。阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinB,诱导表达6 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验。结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽基因已整合到酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较高抗菌活性的抗菌肽,表达产物具有较强杀菌作用。 展开更多

关键词 牛乳铁多肽(LfcinB) 毕赤酵母表达系统 抗菌活性

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白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化 被引量：4

10

作者 郭芝光 尉亚辉 +2 位作者 刘蕾 张儒 朱剑光 《西北大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期263-266,共4页

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5... 目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。 展开更多

关键词 白藜芦醇 白藜芦醇合酶 基因克隆 毕赤酵母表达系统

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乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达 被引量：4

11

作者 孙明颢 叶林伯 +2 位作者 郜金荣 贺石汉 吴正辉 《中国病毒学》 CSCD 2003年第2期99-103,共5页

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1 203bp.克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr... 应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1 203bp.克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型。有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点。然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal I线性化的pPIC9K-preS质粒用电击法导入巴斯德—毕赤酵母GS115His-中。通过MD-G418平板筛选和5AOX1和3AOX1引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长preS基因的His+Mut+酵母工程菌株。此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长PreS蛋白并可分泌到培养液中,SDS-PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的PreS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒 全长PreS蛋白基因 ADR亚型 疫苗 毕赤酵母表达系统

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巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 被引量：2

12

作者 姚春阳 沈旭 庄金秋 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2008年第2期26-28,共3页

关键词 毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母 外源基因表达 酿酒酵母 生物学特性 蛋白质表达 生物学领域 外源蛋白

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Neuritin毕赤酵母表达系统的构建及其对PC12细胞的影响 被引量：5

13

作者 张树军 赵臣 +4 位作者 狄建军 穆莎茉莉 仙玲玲 于娜 黄瑾 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期148-152,共5页

旨在构建Neuritin的毕赤酵母表达系统获得大量有活性的Neuritin蛋白,研究其神经生物学功能。PCR扩增编码neuritin基因cDNA序列,并纯化回收,通过酶切和连接插入穿梭载体pPIC9K中,转化大肠杆菌DH5α,neuritin-pPIC9k重组质粒经PCR与测序... 旨在构建Neuritin的毕赤酵母表达系统获得大量有活性的Neuritin蛋白,研究其神经生物学功能。PCR扩增编码neuritin基因cDNA序列,并纯化回收,通过酶切和连接插入穿梭载体pPIC9K中,转化大肠杆菌DH5α,neuritin-pPIC9k重组质粒经PCR与测序鉴定后,使用SalⅠ酶切使其线性化,电击转化酵母菌GS115,经筛选与鉴定,成功构建了Neuritin的毕赤酵母表达系统。结果表明,使用甲醇诱导其表达,SDS-PAGE和Western blot分析得到11 kD的Neuritin蛋白,纯化的Neuritin蛋白加入PC12细胞培养液中,能促进其突起的生长。 展开更多

关键词 NEURITIN PPIC9K 毕赤酵母表达系统 PC12细胞

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重组人骨形态发生蛋白-7表达系统研究进展 被引量：4

14

作者 安新玲 韩金祥 王世立 《生物技术通讯》 CAS 2009年第6期846-848,873,共4页

骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在胚胎发育、肾脏保护、骨形成、代谢、再生等各个方面发挥着重要的作用,现已进入了临床应用阶段。我们简要综述了重组人BMP-7(rhBMP-7)的原核表达系统及真核表达系统,并对各表达系统的优缺点进行了分析。

关键词 骨形态发生蛋白-7 大肠杆菌表达系统 毕赤酵母表达系统 CHO细胞表达系统 腺病毒

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鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达 被引量：4

15

作者 刘一尘 张春杰 +5 位作者 程安春 程相朝 汪铭书 李银聚 吴庭才 易明林 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期502-506,共5页

为使鸡IL-18成熟蛋白基因在真核系统中高效表达,对其进行定点突变,将酵母低频密码子突变为偏嗜性密码子,构建了鸡IL-18成熟蛋白变构基因真核重组表达载体pPICZαA-MChIL18*,并将其转化入P.pastorisX-33。重组菌株X-33/pPICZαA-MChIL18... 为使鸡IL-18成熟蛋白基因在真核系统中高效表达,对其进行定点突变,将酵母低频密码子突变为偏嗜性密码子,构建了鸡IL-18成熟蛋白变构基因真核重组表达载体pPICZαA-MChIL18*,并将其转化入P.pastorisX-33。重组菌株X-33/pPICZαA-MChIL18*经甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE检测,结果在约23 000处有目的条带,与预期的相对分子质量一致,占总蛋白的45%,对其进行Western-blot检测,结果与兔抗鸡IL-18多克隆抗体发生特异性免疫反应。结果表明,鸡IL-18成熟蛋白变构基因在毕赤酵母中成功的进行了表达。 展开更多

关键词 鸡IL-18 定点突变 毕赤酵母表达系统 SDS-PAGE WESTERN-BLOT

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人胰腺α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用 被引量：4

16

作者 齐西珍 任丽梅 +3 位作者 郑芳 张奇 白芳 白钢 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期1106-1112,共7页

【目的】针对人胰腺α-淀粉酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人胰腺α-淀粉酶;利用酶的催化特性建立α-淀粉酶抑制剂筛选模型;应用该模型对放线菌发酵液冻... 【目的】针对人胰腺α-淀粉酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人胰腺α-淀粉酶;利用酶的催化特性建立α-淀粉酶抑制剂筛选模型;应用该模型对放线菌发酵液冻干物进行高通量筛选;通过构建16S rRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】成功克隆、表达了具催化活性的人胰腺α-淀粉酶;建立了α-淀粉酶抑制剂的筛选模型;对近2000株放线菌的发酵液冻干物进行高通量筛选,最终得到14株α-淀粉酶抑制剂产生菌株,且在分类学上具有丰富的菌种多样性。【结论】本研究建立的α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型淀粉酶抑制剂类降糖药物的开发。 展开更多

关键词 Α-淀粉酶抑制剂 毕赤酵母表达系统 人胰腺α-淀粉酶 放线菌 高通量药筛

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肝癌靶标GPC3纳米抗体在毕赤酵母表达系统的表达及鉴定

17

作者 覃永康 杨原隆 +1 位作者 黄声强 张筱晨 《中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生》 2023年第9期84-89,共6页

通过基因克隆技术构建重组毕赤酵母表达系统,探究GPC3纳米抗体在毕赤酵母的表达情况,为GPC3纳米抗体药物在肿瘤靶向诊治方面的应用提供基础。将GPC3纳米抗体基因插入pPICZα表达载体,构建重组质粒。用电转化的方法将线性化的重组质粒转... 通过基因克隆技术构建重组毕赤酵母表达系统,探究GPC3纳米抗体在毕赤酵母的表达情况,为GPC3纳米抗体药物在肿瘤靶向诊治方面的应用提供基础。将GPC3纳米抗体基因插入pPICZα表达载体,构建重组质粒。用电转化的方法将线性化的重组质粒转入野生型毕赤酵母X33,筛选鉴定阳性重组子。优化阳性重组子诱导蛋白表达的条件:诱导时间、诱导温度、诱导剂甲醇浓度,探索蛋白最佳表达条件。SDS-PAGE检测上清液蛋白表达情况,实验结果显示,阳性重组菌株用终浓度为1%的甲醇,在26℃下诱导144h纳米抗体表达量最高。成功获得分泌表达GPC3纳米抗体的毕赤酵母,获得分子量为17 kDa的GPC3纳米抗体。为酵母系统工业化生产GPC3纳米抗体提供理论支持,也为进一步研究GPC3纳米抗体靶向药物治疗肝癌提供物质基础。 展开更多

关键词 肝细胞癌 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 纳米抗体 毕赤酵母表达系统

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改良的幽门螺杆菌噬菌体裂解酶在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的活性差异 被引量：3

18

作者 徐登圆 赵珊珊 +5 位作者 窦俊 方宏清 徐晓峰 支艳艳 李晓稳 文良柱 《生物技术通讯》 CAS 2020年第6期641-647,共7页

目的:改良型幽门螺杆菌噬菌体裂解酶由具有穿透外膜作用的疏水多肽和幽门螺杆菌噬菌体编码的裂解酶和穴蛋白构成,比较其在大肠杆菌和毕赤酵母中表达活性的差异。方法:构建的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母X33,经过表达纯... 目的:改良型幽门螺杆菌噬菌体裂解酶由具有穿透外膜作用的疏水多肽和幽门螺杆菌噬菌体编码的裂解酶和穴蛋白构成,比较其在大肠杆菌和毕赤酵母中表达活性的差异。方法:构建的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母X33,经过表达纯化得到改良型裂解酶,体外通过滤纸片法和液体法比较不同表达系统所表达的改良型裂解酶的活性差异。结果:体外抑菌实验表明,大肠杆菌表达的改良型裂解酶的溶菌效果明显强于毕赤酵母表达的改良型裂解酶。结论:2种表达系统各有优势,就活性而言,大肠杆菌表达系统更佳,毕赤酵母表达系统对外源蛋白的糖基化修饰影响改良型裂解酶活性。 展开更多

关键词 幽门螺杆菌 噬菌体裂解酶和穴蛋白 大肠杆菌表达系统 毕赤酵母表达系统 抑菌活性

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大腹园蛛次壶腹腺丝的表达 被引量：3

19

作者 杨子江 陈格飞 孟清 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期1323-1331,共9页

基于大腹园蛛次壶腹腺丝Minor Ampullate Spidroin全长编码基因最新报道,研究了该基因的表达。利用PCR扩增该基因重复区一段长1 348 bp的片段P1,融合his-tag标签,构建酵母表达载体,在毕赤酵母菌GS115进行表达。同时构建大肠杆菌表达载体... 基于大腹园蛛次壶腹腺丝Minor Ampullate Spidroin全长编码基因最新报道,研究了该基因的表达。利用PCR扩增该基因重复区一段长1 348 bp的片段P1,融合his-tag标签,构建酵母表达载体,在毕赤酵母菌GS115进行表达。同时构建大肠杆菌表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,P1在两种表达系统中均可实现表达。研究结果显示:P1在GS115中的表达经优化后产量、产率有较大提高,且远高于BL21(DE3)中的表达,相应的纯化效率GS115也远高于对照BL21(DE3)的表达。研究表明酵母表达系统更适合重复度高、且富含Gly/Ala的天然蛛丝蛋白基因的表达,为表达全长天然MiSp编码序列提供前期实验基础,也为大规模蛛丝蛋白的重组表达建立了平台。 展开更多

关键词 次壶腹腺丝蛋白 毕赤酵母表达系统 大肠杆菌表达系统

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黑曲霉葡萄糖氧化酶基因改造及其在毕赤酵母中的表达 被引量：3

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作者 聂金梅 李阳源 +2 位作者 刘金山 王勇 唐业 《江苏农业科学》 2018年第20期17-21,共5页

为构建并筛选高效表达的葡萄糖氧化酶基因毕赤酵母工程菌株,采用PCR法从黑曲霉基因组中获得葡萄糖氧化酶全长基因(GOD),采用定点突变法和重叠PCR法获得GOD^(mut)基因,将其插入到pPICZαA中,获得重组质粒pPIC-GOD^(mut),经Pme I线性化后... 为构建并筛选高效表达的葡萄糖氧化酶基因毕赤酵母工程菌株,采用PCR法从黑曲霉基因组中获得葡萄糖氧化酶全长基因(GOD),采用定点突变法和重叠PCR法获得GOD^(mut)基因,将其插入到pPICZαA中,获得重组质粒pPIC-GOD^(mut),经Pme I线性化后,用电击法转化毕赤酵母菌株X33,经大量筛选,获得1株高效分泌表达的工程菌株X33-pPIC-GOD^(mut),在此基础上,去除GOD基因的信号肽,用同样的试验方法构建并筛选高效分泌表达的工程菌株X33-pPIC-GODnew,结果表明:X33-pPIC-GOD^(mut)的产酶水平为460. 3 U/mL,X33-pPIC-GODnew的产酶水平为714. 9 U/mL,是前者的1. 52倍,该酶的最适作用温度和最适作用pH值分别为40℃和5. 0,成功获得1株高效稳定表达的葡萄糖氧化酶基因毕赤酵母工程菌株。 展开更多

关键词 葡萄糖氧化酶 黑曲霉 毕赤酵母表达系统 信号肽

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