目的构建带Flag标签的RING结构泛素连接酶26(Ring finger protein 26,RNF26)真核表达载体,表达Flag-RNF26的融合蛋白,通过细胞免疫荧光实验,观察其在人肝癌细胞HepG2中的定位及与带绿色荧光蛋白标签的死骨片1(sequestosome 1,SQSTM1)是...目的构建带Flag标签的RING结构泛素连接酶26(Ring finger protein 26,RNF26)真核表达载体,表达Flag-RNF26的融合蛋白,通过细胞免疫荧光实验,观察其在人肝癌细胞HepG2中的定位及与带绿色荧光蛋白标签的死骨片1(sequestosome 1,SQSTM1)是否存在共定位。方法以人乳腺文库为模板,应用PCR技术扩增出RNF26的编码区序列,双酶切后插入带Flag标签的pCMV-Tag2B载体中,构建pCMV-Tag2B-RNF26重组质粒;将测序正确的重组质粒和pCMV-Tag2B空载体分别转染人胚肾293T细胞中,Western印迹检测融合蛋白表达情况,将成功表达的质粒pCMV-Tag2B-RNF26与pEGFP-SQSTM1质粒转染至人肝癌细胞HepG2中,进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察SQSTM1和RNF26的共定位情况。结果插入片段的DNA序列测序结果与目的基因序列相同,Western印迹检测提示,融合蛋白成功表达;免疫荧光结果表明,RNF26与SQSTM1蛋白在细胞质中存在共定位。结论pCMVTag2B-RNF26真核表达载体构建成功。带Flag标签的人RNF26蛋白在HepG2细胞内成功表达,且与SQSTM1蛋白存在共定位,为进一步研究RNF26和SQSTM1的相互作用关系建立了实验基础。展开更多
文摘目的构建带Flag标签的RING结构泛素连接酶26(Ring finger protein 26,RNF26)真核表达载体,表达Flag-RNF26的融合蛋白,通过细胞免疫荧光实验,观察其在人肝癌细胞HepG2中的定位及与带绿色荧光蛋白标签的死骨片1(sequestosome 1,SQSTM1)是否存在共定位。方法以人乳腺文库为模板,应用PCR技术扩增出RNF26的编码区序列,双酶切后插入带Flag标签的pCMV-Tag2B载体中,构建pCMV-Tag2B-RNF26重组质粒;将测序正确的重组质粒和pCMV-Tag2B空载体分别转染人胚肾293T细胞中,Western印迹检测融合蛋白表达情况,将成功表达的质粒pCMV-Tag2B-RNF26与pEGFP-SQSTM1质粒转染至人肝癌细胞HepG2中,进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察SQSTM1和RNF26的共定位情况。结果插入片段的DNA序列测序结果与目的基因序列相同,Western印迹检测提示,融合蛋白成功表达;免疫荧光结果表明,RNF26与SQSTM1蛋白在细胞质中存在共定位。结论pCMVTag2B-RNF26真核表达载体构建成功。带Flag标签的人RNF26蛋白在HepG2细胞内成功表达,且与SQSTM1蛋白存在共定位,为进一步研究RNF26和SQSTM1的相互作用关系建立了实验基础。
