农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选 被引量：23

1

作者 刘朋娟 王政逸 +1 位作者 王秋华 李德葆 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期231-237,共7页

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮... 在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T-DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体:A1-412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1-412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1-412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern杂交显示A1-412基因组中T-DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1-412突变体表型的改变可能是由于T-DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。 展开更多

关键词 稻瘟病菌 根癌农杆菌介导转化 插入突变 致病缺陷突变体

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根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立 被引量：10

2

作者 杨迎青 杨媚 +3 位作者 李明海 李勇 贺晓霞 周而勋 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期617-622,共6页

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等... 为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中。 展开更多

关键词 水稻纹枯病 立枯丝核菌 根癌农杆菌介导转化 T-DNA插入诱变 方法

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草酸氧化酶基因转化烟草的研究 被引量：6

3

作者 景岚 康振生 +1 位作者 孙燕飞 张岗 《西北植物学报》 CAS CSCD 2004年第10期1845-1849,共5页

为研究草酸氧化酶基因(OxO)对植物抗病的作用,将含有CaMV35s启动子的植物表达载体以根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的叶盘方法,转化了烟草97131。具有卡那霉素抗性的再生植株经PCR检测,得到了与阳性对照一致的470bp的片段,... 为研究草酸氧化酶基因(OxO)对植物抗病的作用,将含有CaMV35s启动子的植物表达载体以根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的叶盘方法,转化了烟草97131。具有卡那霉素抗性的再生植株经PCR检测,得到了与阳性对照一致的470bp的片段,进一步对PCR产物测序表明OxO基因已整合进烟草基因组中。在对草酸的耐受性实验中,转基因烟草对草酸的抗性明显高于未转化烟草。 展开更多

关键词 草酸氧化酶基因(OxO) 根癌农杆菌介导转化 转基因烟草 耐受性

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根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达 被引量：3

4

作者 潘力 王云艳 +2 位作者 王斌 何攀 李俊星 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第5期84-89,共6页

黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉... 黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1,通过PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等确定成功获得了RML的黑曲霉转化子,并通过发酵条件优化实现了RML的高效表达,对硝基苯酚比色法测得转化子酶活最高可达15 U/mL,是其在酵母中表达水平的10倍以上. 展开更多

关键词 无孢黑曲霉 根癌农杆菌介导转化 米黑根毛霉脂肪酶 基因表达

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一种根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的新方法 被引量：1

5

作者 鲍广稳 祝嫦巍 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1168-1171,共4页

设计了一种简单高效的根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的方法。利用嵌套平板的方法,在内层平板培养平菇菌丝,待菌丝生长至平板边缘,将经诱导的根癌农杆菌与共培养培养基(CCM)混合,倒入内层平板与外层平板的间隙中,与正在生长中的菌丝共培... 设计了一种简单高效的根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的方法。利用嵌套平板的方法,在内层平板培养平菇菌丝,待菌丝生长至平板边缘,将经诱导的根癌农杆菌与共培养培养基(CCM)混合,倒入内层平板与外层平板的间隙中,与正在生长中的菌丝共培养,实现转化,利用潮霉素抗性筛选获得转化子,平均转化效率33%左右。此方法操作简单,周期短,极易扩大实验规模,为平菇的分子育种以及其他丝状真菌的遗传转化提供参考。 展开更多

关键词 根癌农杆菌介导转化 菌丝体 平菇

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香灰菌gpd启动子的克隆及功能验证 被引量：1

6

作者 陈悦 刘冬梅 +2 位作者 许丹云 王媛媛 马爱民 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2019年第17期97-103,共7页

为了构建香灰菌的转化体系,研究香灰菌的基因功能,需要获得高活性的启动子元件。本实验通过PCR技术分别克隆得到gpd基因以及其基因上游约1000 bp序列,使用Neural Network Promoter Prediction、Signal Scan Search Request、PLANTCAREA ... 为了构建香灰菌的转化体系,研究香灰菌的基因功能,需要获得高活性的启动子元件。本实验通过PCR技术分别克隆得到gpd基因以及其基因上游约1000 bp序列,使用Neural Network Promoter Prediction、Signal Scan Search Request、PLANTCAREA database软件分析发现,gpd基因上游区域内不仅包含启动子所需的特征核心元件TATA-box、CAAT-box、G-box、GC-box、CT-rich等,还含有一个高分值的转录起始位点。为进一步验证该序列的启动子功能,将gpd启动子元件与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)和潮霉素基因(hph)连接构建成融合表达载体,通过根癌农杆菌介导将其转化香灰菌丝。潮霉素抗性筛选、绿色荧光蛋白检测结果显示,香灰菌gpd启动子成功驱动了潮霉素抗性基因和增强型绿色荧光蛋白基因的表达,根癌农杆菌介导转化成功,为香灰菌外源基因表达及基因功能的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 香灰菌 GPD 启动子 载体构建 根癌农杆菌介导转化

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新一代高产甘油重组菌的构建及其初步发酵

7

作者 刘爱玲 饶志明 +3 位作者 马正 诸葛斌 方慧英 诸葛健 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期946-952,共7页

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes WL2002-5)是一株发酵生产甘油的工业化菌株。为进一步提高其产甘油能力,本研究利用前期研究中成功克隆的产甘油假丝酵母中甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD1,构建根癌农杆菌双元载体pCAM... 产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes WL2002-5)是一株发酵生产甘油的工业化菌株。为进一步提高其产甘油能力,本研究利用前期研究中成功克隆的产甘油假丝酵母中甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD1,构建根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1后,电击转化根癌农杆菌LBA4404,通过根癌农杆菌介导法(ATMT)转化产甘油假丝酵母,构建了产甘油假丝酵母重组菌。并从中筛选出一株酶活力和产甘油性能较好的产甘油假丝酵母重组菌株C.g-G8。以葡萄糖为底物摇瓶发酵96h后,重组菌C.g-G8的甘油产量比野生型菌株Candida glycerinogene提高18.06%,平均耗糖速率提高12.97%,平均酶活力提高27.55%。本研究成功利用ATMT法转化产甘油假丝酵母构建新一代高产甘油菌株。 展开更多

关键词 产甘油假丝酵母 胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶 根癌农杆菌介导转化

原文传递

融合疏水蛋白在银耳中的异源表达

8

作者 陈少敏 朱涵予 +2 位作者 刘冬梅 许丹云 马爱民 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2018年第14期115-119,共5页

为改善疏水蛋白的性质,充分利用疏水蛋白和银耳的可食性优势,将平菇疏水蛋白基因hyd与去除终止密码子的hyd拼接,形成融合疏水蛋白H-H,并构建其表达载体p EGH-H-H。通过电击法将p EGH-H-H导入到根癌农杆菌EHA105中,并转化到银耳芽孢。转... 为改善疏水蛋白的性质,充分利用疏水蛋白和银耳的可食性优势,将平菇疏水蛋白基因hyd与去除终止密码子的hyd拼接,形成融合疏水蛋白H-H,并构建其表达载体p EGH-H-H。通过电击法将p EGH-H-H导入到根癌农杆菌EHA105中,并转化到银耳芽孢。转化子经潮霉素抗性筛选,PCR检测后,随机挑取10个转化子进行Southern blot,筛选获得高拷贝且能稳定遗传的转化子。实时荧光定量PCR分析显示5号转化子的疏水蛋白相对表达量是野生型的11.4倍。最后提取5号转化子中的融合疏水蛋白,经SDS-PAGE检测,证明融合疏水蛋白在银耳中成功异源表达。起泡性和乳化性实验表明,转化子融合疏水蛋白较平菇疏水蛋白有一定的提升。 展开更多

关键词 融合疏水蛋白 根癌农杆菌介导转化 银耳 起泡性 乳化性

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用T-DNA插入突变的方法获得稻瘟病菌致病突变体

9

作者 李亚 孔慧敏 +3 位作者 梁慎 方敏彦 阎霞 王政逸 《浙江农业学报》 CSCD 2008年第6期391-395,共5页

利用农杆菌介导转化的方法共得到1 114个稻瘟病菌转化子,经感病大麦和水稻离体叶片接种鉴定获得3个致病缺陷或下降突变体:A1-134、A1-452、和A2-1-8,其中A1-134和A1-452的致病性下降,而A2-1-8突变体的致病性丧失。对这些突变体的分生孢... 利用农杆菌介导转化的方法共得到1 114个稻瘟病菌转化子,经感病大麦和水稻离体叶片接种鉴定获得3个致病缺陷或下降突变体:A1-134、A1-452、和A2-1-8,其中A1-134和A1-452的致病性下降,而A2-1-8突变体的致病性丧失。对这些突变体的分生孢子形态、产孢、附着胞形成等表型分析的结果发现,A1-134突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株Guy11的7.7%,分生孢子为圆球形,无隔膜或只有一个隔膜;A1-452产孢量明显增多,为Guy11的22倍;A2-1-8的分生孢子为长针形,产孢量略有下降;A1-134和A1-452在疏水表面的附着胞形成率与Guy11相近,而A2-1-8则不能形成附着胞。研究结果为进一步鉴定和分离这些突变体的T-DNA标记基因奠定了基础。 展开更多

关键词 稻瘟病菌 根癌农杆菌介导转化 T-DNA插入突变 致病突变体

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南丰蜜橘胚性愈伤组织诱导及其转化研究

10

作者 段艳欣 范净 郭文武 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2009年第8期42-45,共4页

南丰蜜橘是原产于中国的古老柑橘品种,其果实皮薄而肉甜,深受消费者喜爱,当前南丰蜜橘的品质发生劣变,影响了其商品价值。为采用基因工程育种以改善南丰蜜橘品质,通过诱导其愈伤组织并以其为试材进行了转基因研究。南丰蜜橘自种子实生... 南丰蜜橘是原产于中国的古老柑橘品种,其果实皮薄而肉甜,深受消费者喜爱,当前南丰蜜橘的品质发生劣变,影响了其商品价值。为采用基因工程育种以改善南丰蜜橘品质,通过诱导其愈伤组织并以其为试材进行了转基因研究。南丰蜜橘自种子实生苗下胚轴处长产生出愈伤组织,挑选胚性愈伤组织进行增殖后,采用根癌农杆菌介导法进行开花相关基因AP1的转化。结果获得22团抗性愈伤组织,平均产出率为7.3团/皿,表明该品种有较高的转化率。抗性愈伤组织经PCR分析、Southern blot检测证实为转化子。研究结果表明南丰蜜橘胚性愈伤组织是基因工程改良的良好受体,可用于其他基因的转化研究。 展开更多

关键词 根癌农杆菌介导转化 胚性愈伤组织 南丰蜜橘 PCR分析 SOUTHERN blotting检测

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《生物技术通报》2008年总目次

11

《生物技术通报》 CAS CSCD 2008年第6期188-193,共6页

关键词 技术通报 研究进展 根癌农杆菌介导转化 序列分析 酵母表达载体 目次

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根癌农杆菌介导的香蕉高效遗传转化系统的建立 被引量：15

12

作者 胡春华 魏岳荣 +2 位作者 易干军 黄秉智 黄永红 《分子植物育种》 CAS CSCD 2010年第1期172-178,共7页

为建立根癌农杆菌介导的香蕉高效遗传转化系统,本研究以雄性花诱导产生的贡蕉胚性悬浮系为转化受体,从潮霉素筛选浓度和筛选方法两方面进行了优化。研究结果表明,贡蕉悬浮系在M2液体培养下潮霉素的适合筛选浓度为5mg/L。将液体共培养7d... 为建立根癌农杆菌介导的香蕉高效遗传转化系统,本研究以雄性花诱导产生的贡蕉胚性悬浮系为转化受体,从潮霉素筛选浓度和筛选方法两方面进行了优化。研究结果表明,贡蕉悬浮系在M2液体培养下潮霉素的适合筛选浓度为5mg/L。将液体共培养7d后的贡蕉胚性悬浮系转接到M2液体筛选培养基进行培养,每10d继代一次。GUS组织染色表明,经过3代抗性筛选的ECS几乎全为转化细胞。经过3个月的胚诱导培养获得成熟抗性体细胞胚,平均抗性体细胞胚得率为4580个/mLPCV。同时,转化苗的PCR检测结果表明,gus基因已整合到贡蕉基因组中。本研究表明液体筛选系统有利于转化胚性悬浮细胞的增殖,大大地提高了香蕉转基因的转化效率。 展开更多

关键词 香蕉 根癌农杆菌介导转化法 液体共培养

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根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统的构建 被引量：3

13

作者 陈凤 王坤 +3 位作者 银超 李德明 任楠 李俊星 《安徽农业科学》 CAS 2012年第16期8800-8805,共6页

[目的]建立根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统,探讨利用泡盛曲霉表达异源蛋白的可行性。[方法]从国内主要菌种库中购买泡盛曲霉菌株,根据分泌蛋白图谱分析确定合适的宿主菌,在此基础上通过药物敏感性分析确定遗传转化的选择标记,并... [目的]建立根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统,探讨利用泡盛曲霉表达异源蛋白的可行性。[方法]从国内主要菌种库中购买泡盛曲霉菌株,根据分泌蛋白图谱分析确定合适的宿主菌,在此基础上通过药物敏感性分析确定遗传转化的选择标记,并利用构建的泡盛曲霉遗传转化体系对米黑根毛霉脂肪酶基因RML进行转化、表达研究,通过转化子鉴定及性质分析考察泡盛曲霉作为异源蛋白表达系统的可行性。[结果]通过分泌蛋白图谱分析确定泡盛曲霉CBS115.52和CICC2257作为异源蛋白表达的宿主菌;药物敏感性试验确定潮霉素抗性基因(HygBr)作为有效的遗传选择标记;在此基础上,利用根癌农杆菌介导的转化方法(agrobacterium tumefaciensmediated transformation,ATMT),将带有HygBr的质粒pHGW-amdS成功导入泡盛曲霉宿主菌CBS115.52,建立以HygBr为选择标记的泡盛曲霉遗传转化体系。利用该体系,介导米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)的表达载体转化泡盛曲霉,通过底物水解试验、SDS-PAGE及Western blot确定RML基因已在泡盛曲霉中表达。[结论]该研究证明了根癌农杆菌介导转化泡盛曲霉作为异源蛋白的表达体系具有潜在的可行性。 展开更多

关键词 泡盛曲霉 根癌农杆菌介导转化(ATMT) 潮霉素抗性基因 米黑根毛霉脂肪酶(RML)

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根癌农杆菌介导的马铃薯转化系统的优化 被引量：19

14

作者 熊伟 马耀华 +1 位作者 胡碧波 陈保善 《广西农业生物科学》 CAS CSCD 2007年第1期1-7,共7页

以马铃薯品种PB04的叶片和茎段为外植体，对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。分别比较不同转化条件（菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间）对马铃薯遗传转化效率的影响，以及选择压浓度和加入时间对抗性愈伤出芽的影... 以马铃薯品种PB04的叶片和茎段为外植体，对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。分别比较不同转化条件（菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间）对马铃薯遗传转化效率的影响，以及选择压浓度和加入时间对抗性愈伤出芽的影响，结果表明：（1）在玉米素（ZT）2mg／L，萘乙酸（NAA）0．01mg／L条件下能有效地提高马铃薯愈伤组织分化率；（2）外植体经过2d的预培养，在OD600=0．8的农杆菌菌液中侵染10min后，抗性愈伤诱导率最高。（3）头孢霉素（Cef）比羧苄青霉素（Car）更适合用于马铃薯外植体的遗传转化。（4）农杆菌侵染后恢复培养5～7d再加入卡那霉素（Km）50mg／L能有效地提高外植体的转化率。 展开更多

关键词 根癌农杆菌介导的遗传转化 马铃薯 外植体 系统优化

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农杆菌介导的甜瓜蔓枯病菌遗传转化体系的建立 被引量：6

15

作者 任海英 方丽 +2 位作者 李岗 茹水江 王汉荣 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期802-808,共7页

甜瓜蔓枯病是当前危害瓜类的主要病害,严重影响甜瓜的产量和品质,但是蔓枯病菌Didymella bryoniae病原学研究还非常落后,关于该菌功能基因的研究还未见报道。本研究以携带潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)的pBIG2RHPH2作为转化载体,根癌农杆... 甜瓜蔓枯病是当前危害瓜类的主要病害,严重影响甜瓜的产量和品质,但是蔓枯病菌Didymella bryoniae病原学研究还非常落后,关于该菌功能基因的研究还未见报道。本研究以携带潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)的pBIG2RHPH2作为转化载体,根癌农杆菌C58C1作为转化介体,转化甜瓜蔓枯病菌的强致病菌株DB11。研究发现,甜瓜蔓枯病菌的最优转化体系为:甜瓜蔓枯病菌的分生孢子悬浮液浓度为1×106个孢子/mL,农杆菌悬浮液OD600为0.15,共培养时间48h,诱导培养基中添加200μg/mL乙酰丁香酮,选择培养基添加100μg/mL潮霉素B、200μg/mL头孢噻肟钠、200μg/mL氨苄青霉素和200μg/mL四环素。1×105个蔓枯病菌分生孢子可以产生45个左右的转化子,随机挑取3个转化子进行PCR和RT-PCR检测发现,在不含潮霉素B的PDA培养基平板上转化子连续培养5代后,hph基因仍能稳定存在和转录,Southern blotting检测发现,T-DNA都是单拷贝插入3个转化子的染色体内。本研究建立的甜瓜蔓枯病菌的转化体系将为该病菌的功能基因研究和寄主与病原菌的互作研究提供重要技术支撑。 展开更多

关键词 甜瓜蔓枯病菌 根癌农杆菌介导的转化 T-DNA插入突变

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根癌农杆菌介导双价载体pPK2转化黑曲霉条件的研究 被引量：5

16

作者 王艳 王文雅 袁其朋 《食品科技》 CAS 北大核心 2013年第8期56-61,共6页

研究探讨了不同条件对双价载体pPK2转化黑曲霉的影响,随后在T-DNA插入的黑曲霉突变体中筛选了木聚糖酶高产菌株。以根癌农杆菌EHA105为介导菌,黑曲霉2459为受体菌株,用潮霉素B基因为筛选标记的研究结果显示,较优的转化条件为:根癌农杆... 研究探讨了不同条件对双价载体pPK2转化黑曲霉的影响,随后在T-DNA插入的黑曲霉突变体中筛选了木聚糖酶高产菌株。以根癌农杆菌EHA105为介导菌,黑曲霉2459为受体菌株,用潮霉素B基因为筛选标记的研究结果显示,较优的转化条件为:根癌农杆菌的诱导时间4h、乙酰丁香酮(AS)的浓度200μmol/L、培养基的pH4.75、根癌农杆菌的初始浓度OD600=0.7、共培养时间36h、受体形式以匀浆处理的黑曲霉菌体为好,在这些条件下pPK2对黑曲霉的转化率达到120cfu/107cfu孢子;转化菌株经过5次连续培养后仍然稳定;突变菌株中,木聚糖酶活性较对照最高提高了86%。上述研究为进一步改造pPK2质粒,将其应用于丝状真菌基因工程奠定了基础。 展开更多

关键词 pPK2 根癌农杆菌介导的转化 黑曲霉 转化效率

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米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型遗传转化体系的构建 被引量：5

17

作者 毕付提 史亚楠 +3 位作者 张久祎 王静然 薛鲜丽 王德培 《食品研究与开发》 CAS 北大核心 2021年第3期189-195,共7页

米曲霉对潮霉素等多种抗生素不敏感,对其基因改造有一定困难。该研究以米曲霉3.042为出发菌株,建立pyrG筛选标记遗传转化体系。首先,分别运用紫外诱变法和左右臂同源重组法破坏米曲霉自身的pyrG基因,在含有5-氟乳清酸和尿苷/尿嘧啶的培... 米曲霉对潮霉素等多种抗生素不敏感,对其基因改造有一定困难。该研究以米曲霉3.042为出发菌株,建立pyrG筛选标记遗传转化体系。首先,分别运用紫外诱变法和左右臂同源重组法破坏米曲霉自身的pyrG基因,在含有5-氟乳清酸和尿苷/尿嘧啶的培养基平板进行筛选,最终两种方法分别获得性状稳定的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变株米曲霉O11和米曲霉g-1。随后以缺陷型突变株为出发菌株,利用农杆菌转化法转入包含pyrG回补标记的质粒,其中米曲霉g-1突变株获得原养型的回补菌株,紫外诱变法获得的缺陷型突变菌株米曲霉O11未能恢复为原养型。研究表明米曲霉3.042 pyrG基因大片段缺失的缺陷型菌株,可直接以自身pyrG基因作为选择标记进行遗传改造。 展开更多

关键词 米曲霉3.042 尿苷/尿嘧啶营养缺陷型 紫外诱变 根癌农杆菌介导的转化法 pyrG

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利用根癌农杆菌T-DNA插入突变寻找参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因 被引量：4

18

作者 李中明 潘皎 朱旭东 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期44-51,共8页

【目的】新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是人类重要致病真菌,主要毒性因子之一漆酶的表达受葡糖糖阻遏,机制未知。本文拟寻找参与葡萄糖阻遏的关键基因。【方法】建立根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefanciens-medi... 【目的】新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是人类重要致病真菌,主要毒性因子之一漆酶的表达受葡糖糖阻遏,机制未知。本文拟寻找参与葡萄糖阻遏的关键基因。【方法】建立根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefanciens-mediated transformation,ATMT)建立一个容量约200000的随即插入突变文库,在高浓度葡萄糖条件下从中筛选葡萄糖去阻遏的突变株。通过Southern确定突变株中T-DNA的拷贝数,利用反向PCR获得依赖葡萄糖的漆酶阻遏基因序列。【结果】筛选到了30株葡萄糖去阻遏突变株,Southern blot发现83%的葡萄糖去抑制突变株含有单个T-DNA拷贝。初步鉴定了可能参与漆酶阻遏的10个不同生物学功能基因,如参与碳水化合物的代谢,固醇的合成,几丁质的合成,GPI脂锚钩的合成等等。【结论】ATMT突变策略可以找到一些参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因,为理解漆酶在致病过程中的作用机制和工业改进漆酶活性提供参考。 展开更多

关键词 新型隐球酵母 根癌农杆菌介导的转化 漆酶

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黑曲霉pyrG遗传转化系统的构建及应用 被引量：3

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作者 胡江峰 刘舒雯 +3 位作者 杨焱 李林霖 李迎凯 张健 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期15-19,共5页

用于黑曲霉遗传操作的筛选标记基因非常有限,而基因改造往往涉及诸多基因的敲除或表达,有限的筛选标记基因难以满足需要。该文构建了以pyrG为筛选标记的黑曲霉遗传转化系统,并利用该系统使红色荧光蛋白rfp在黑曲霉中成功表达。首先,运... 用于黑曲霉遗传操作的筛选标记基因非常有限,而基因改造往往涉及诸多基因的敲除或表达,有限的筛选标记基因难以满足需要。该文构建了以pyrG为筛选标记的黑曲霉遗传转化系统,并利用该系统使红色荧光蛋白rfp在黑曲霉中成功表达。首先,运用同源重组原理完全敲除pyrG基因,在含有5-氟乳清酸和尿苷/尿嘧啶的培养基平板进行筛选,获得1株稳定遗传的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株黑曲霉ng-1。然后构建了以pyrG作为回补标记,以三磷酸甘油醛脱氢酶启动子gpdA来调节rfp基因表达的质粒,将质粒转入农杆菌AGL1并侵染黑曲霉菌株ng-1,成功获得了黑曲霉rfp表达菌株,表明pyrG筛选标记可成功用于黑曲霉的遗传转化。 展开更多

关键词 黑曲霉 pyrG 根癌农杆菌介导的转化法 筛选标记 红色荧光蛋白

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农杆菌介导的蛹虫草营养缺陷型菌株和遗传转化体系的构建 被引量：2

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作者 王立 黄慧 +3 位作者 刘新平 王兴明 曾斌 胡志宏 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期3373-3386,共14页

【背景】天然蛹虫草是蛹虫草菌侵染昆虫蛹或虫形成的子实体,具有非常重要的生物药理活性。目前蛹虫草基因组测序已经完成,但是其分子生物学研究较少。【目的】在蛹虫草中构建一种以尿苷/尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌介导的转基... 【背景】天然蛹虫草是蛹虫草菌侵染昆虫蛹或虫形成的子实体,具有非常重要的生物药理活性。目前蛹虫草基因组测序已经完成,但是其分子生物学研究较少。【目的】在蛹虫草中构建一种以尿苷/尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌介导的转基因体系。【方法】乳清酸核苷-5′-磷酸(orotidine-5′-monophosphate,OMP)脱羧酶为尿嘧啶合成必需酶,利用根癌农杆菌介导的转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)方法,通过同源重组对蛹虫草野生型菌株中该酶的编码基因pyrG进行敲除,构建尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变体。然后,利用本实验室已有的米曲霉pyrG为筛选标记的二元转化载体,通过农杆菌转化法对该营养缺陷型菌株进行遗传转化。【结果】通过同源重组法,成功敲除pyrG构建了尿嘧啶营养缺陷型蛹虫草,以此为背景,在22℃共培养66 h,成功对蛹虫草实现转基因,转化效率为(75±35)/106孢子。另外,本研究还发现丝状真菌常用的构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA及α淀粉酶启动子PamyB不能在蛹虫草中驱动GFP或DsRed报告基因表达,而蛹虫草自身延伸因子的启动子IF则能很好地表达GFP荧光报告基因。【结论】本研究构建了一种以尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌介导的转基因体系,为研究蛹虫草重组表达和基因功能提供了一个有前景的基因操作工具。 展开更多

关键词 蛹虫草 根癌农杆菌介导的转化 尿嘧啶营养缺陷型

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