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题名密码子优化后的柞蚕溶菌酶在酵母中的表达及活性测定
被引量：10
- 1
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作者
刘真英
李文利
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机构
大连理工大学生命科学与技术学院
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出处
《微生物学通报》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第2期292-300,共9页
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基金
国家自然科学基金项目(No.31201879)~~
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文摘
【目的】提高柞蚕溶菌酶在毕赤酵母中的表达量,对柞蚕溶菌酶活性进行测定。【方法】根据毕赤酵母密码子偏爱性对柞蚕溶菌酶基因进行优化,并在目的基因3′端加上6个组氨酸标签,优化后的基因克隆至表达p PIC9K载体中,并通过电转化的方法导入毕赤酵母GS115中。利用不同浓度梯度的G418进行高拷贝转化子的筛选,经甲醇诱导实现分泌表达。通过硫酸铵盐析、镍柱亲和层析等工艺分离纯化柞蚕溶菌酶,利用琼脂扩散方法测定柞蚕溶菌酶对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、苍白杆菌及过氧化醋杆菌的抑菌作用,利用比浊法测定酶活大小。【结果】密码子优化后的柞蚕溶菌酶在诱导温度25°C、甲醇量0.75%和p H 7.0条件下实现了最高表达,表达量达到了2.4 g/L,并且纯化后的柞蚕溶菌酶酶活达到23 970 U/mg。【结论】密码子优化后的柞蚕溶菌酶在毕赤酵母中实现了高效表达,纯化后的柞蚕溶菌酶对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、苍白杆菌及过氧化醋杆菌均有抑菌作用。
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关键词
密码子优化
柞蚕溶菌酶
毕赤酵母
抑菌作用
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Keywords
Codon optimization
Antheraea pernyi lysozyme
Pichia pastoris
Antibacterial activity
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分类号
Q78
[生物学—分子生物学]
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题名重组柞蚕溶菌酶在柞蚕蛹中的分泌表达及纯化
- 2
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作者
叶博
岳冬梅
李佩佩
王林美
张波
范琦
赵振军
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机构
辽宁省海洋水产科学研究院
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出处
《蚕业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第4期324-331,共8页
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基金
辽宁省自然科学基金指导计划项目(2019-ZD-0388)。
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文摘
利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统(AnpeNPV expression vector system)在柞蚕蛹体内分泌表达柞蚕溶菌酶(ApLz),并建立重组蛋白的分离纯化方法。选用柞蚕30 kD蛋白信号肽构建分泌型转移表达载体pApBacDual-N1/L21Ap30kDSP,将Aplz基因克隆至该载体中,重组DNA转化感受态细胞DH10B/AnpeBac^(Δcc),通过抗生素抗性及蓝白斑筛选获得重组杆粒AnpeBac^(Δcc/phAplz),并经PCR检测确认。重组杆粒DNA转染Tn-Hi5细胞后得到具有感染性的重组病毒Anpe-NPV^(Δcc/phAplz),。重组病毒感染柞蚕蛹6~7 d后收集柞蚕蛹血淋巴,利用His-tag Purification Resin和StrepTrap HP亲和层析柱对重组ApLz进行两步分离纯化。重组ApLz经SDS-PAGE和Western blot鉴定、蛋白质N端测序分析以及抗菌活性检测,结果显示,重组ApLz可以通过AnpeNPV表达载体系统在柞蚕蛹中得到分泌表达,经过两步层析分离得到的重组ApLz纯度较高,信号肽切割位点与预测相符,纯化的重组ApLz对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌具有良好的抑菌活性。初步研究结果为利用柞蚕蛹规模化制备重组蛋白提供了依据。
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关键词
柞蚕核型多角体病毒表达载体系统
柞蚕溶菌酶
分泌表达
蛋白纯化
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Keywords
Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus expression vector system
Antheraea pernyi lysozyme
Secretory expression
Protein purification
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分类号
S885.1
[农业科学—特种经济动物饲养]
Q819
[农业科学—畜牧兽医]
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题名柞蚕溶菌酶真核表达系统的构建及重组蛋白纯化分析
被引量：1
- 3
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作者
续丹丹
温赛
王凤寰
刘怀然
韩煦
赵飞函
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机构
北京工商大学食品学院生物工程系
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出处
《饲料研究》
CAS
2016年第10期31-37,共7页
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基金
国家自然科学基金青年科学基金资助项目21406005
北京工商大学青年教师科研启动基金项目QNJJ2014-28
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文摘
利用甲醇营养型毕赤酵母对柞蚕溶菌酶进行高效重组表达。首先根据毕赤酵母密码子偏爱性对柞蚕溶菌酶成熟肽基因进行密码子优化,将优化后的基因序列ApLyz克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,构建重组表达载体pPICZαA-ApLyz。重组载体经电转化整合入毕赤酵母菌株GS115基因组中,并利用高质量浓度Zeocin(500μg/mL)抗性平板筛选得到高拷贝转化子。摇瓶发酵显示,甲醇诱导72 h后,高拷贝菌株发酵液中溶菌酶活性为450 U/mL(313 U/mg总蛋白),酶活约为单拷贝菌株的3.1倍。纯化后的重组柞蚕溶菌酶分子质量约14 kDa,酶活为3 870 U/mL,比酶活为20 262 U/mg。酶学性质分析显示,重组柞蚕溶菌酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.5,具有较好的热稳定性。
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关键词
柞蚕溶菌酶
毕赤酵母
密码子优化
高拷贝筛选
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分类号
S814.8
[农业科学—畜牧学]
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题名柞蚕溶菌酶基因的克隆和序列分析
被引量：9
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作者
张波
王林美
叶博
赵振军
范琦
李树英
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机构
辽宁省农业科学院大连生物技术研究所辽宁省野蚕重点实验室
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出处
《蚕业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第3期539-546,共8页
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文摘
采用cDNA末端扩增(RACE)方法及简并引物克隆了柞蚕溶菌酶(Antheraea pernyilysozyme)基因(Gen-Bank登录号:DQ353869)。该基因cDNA序列全长675 bp,由3个外显子和2个内含子组成,其开放读码框(ORF)长420 bp,编码140个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的1-20位氨基酸为信号肽序列,21-140位氨基酸为柞蚕溶菌酶成熟蛋白(分子质量14 kD,等电点8.46)。柞蚕溶菌酶氨基酸序列中含有c型溶菌酶分子所特有的活性中心Glu32、Asp50以及8个半胱氨酸残基,与鳞翅目昆虫溶菌酶的氨基酸序列同源性较高,属非钙结合型c型溶菌酶。柞蚕溶菌酶的模拟三级结构与印度柞蚕(Antheraea mylitta)溶菌酶的三级结构十分相似。
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关键词
柞蚕溶菌酶基因
cDNA末端扩增
生物信息学分析
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Keywords
Antheraea pernyi lysozyme gene
RACE
Bioinformatic analyses
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分类号
S885.1
[农业科学—特种经济动物饲养]
Q78
[农业科学—畜牧兽医]
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题名柞蚕溶菌酶基因在酵母中的表达及对变形链球菌的作用
被引量：6
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作者
王丹
马卫东
于惠娟
范琦
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机构
大连市口腔医院.大连大学附属口腔医院
辽宁省农业科学院大连生物技术研究所
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出处
《实用口腔医学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2007年第5期674-677,共4页
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文摘
目的:建立柞蚕溶菌酶的毕赤酵母表达系统,分析重组的柞蚕溶菌酶对变形链球菌的作用。方法:毕赤酵母表达系统用于柞蚕溶菌酶的表达及纯化。琼脂扩散法用于检测重组柞蚕溶菌酶对变形链球菌的抗菌活性。结果:在毕赤酵母表达系统中表达的柞蚕溶菌酶能够分泌到胞外,并且被糖基化。抑菌圈结果显示重组柞蚕溶菌酶对变形链球菌有抑菌活性。柞蚕溶菌酶在酵母菌中的表达是在5ml/L甲醇诱导下96h达到高峰;纯化的重组柞蚕溶菌酶相对分子质量约为20000。结论:重组的柞蚕溶菌酶具有抑制变形链球菌生长的作用。
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关键词
重组柞蚕溶菌酶
变形链球菌
酵母菌
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Keywords
Recombinant AP-Lysozyme
Streptococcus mutan
Yeasts
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分类号
R780.2
[医药卫生—口腔医学]
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