结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定 被引量：8

1

作者 蒋玉凤 钟森 +3 位作者 史小玲 王明勇 张建军 邓存良 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第5期65-68,47,共5页

目的　用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法　以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物... 目的　用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法　以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体pUCm -T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR反应产物克隆于真核表达载体 pcDNA3 1(+)上。并用脂质体介导真核表达重组质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT - 6转染真核细胞COS - 7,72h后 ,通过SDS -PAGE和免疫印迹鉴定ESAT - 6基因表达的蛋白。结果　用结核杆菌基因ESAT - 6构建重组真核表达质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT-成功 ,通过SDS -PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量 6kDa的特异蛋白 ,免疫印迹证明该 6kDa蛋白能与抗ESAT - 6单克隆抗体反应。结论　结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒成功构建 ,该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6。 展开更多

关键词 结核分支杆菌 ESAT-6 真核表达质粒 蛋白表达 鉴定 早期分泌性抗原靶蛋白

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抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6的新型单克隆抗体的制备及其临床应用 被引量：2

2

作者 游璇 冷建杭 +3 位作者 寿成珉 吴志刚 沈俊娅 黄晟 《中国卫生检验杂志》 CAS 2017年第5期609-611,615,共4页

目的制备抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)单克隆抗体,以应用于多种检测技术和临床研究。方法设计并合成结核分枝杆菌ESAT-6特定抗原肽序列,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经酶联免疫吸附试验(ELISA... 目的制备抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)单克隆抗体,以应用于多种检测技术和临床研究。方法设计并合成结核分枝杆菌ESAT-6特定抗原肽序列,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测、多次有限稀释亚克隆建立能稳定分泌抗结核分枝杆菌特异抗原肽单克隆抗体的杂交瘤细胞系,纯化后行免疫球蛋白亚型分析,并鉴定分析该单克隆抗体在蛋白质免疫印迹法、免疫沉淀法和酶联免疫法(ELISA)检测中的应用效果。收集结核分枝杆菌培养上清液样本38份,非结核分枝杆菌培养上清液样本20份,结核性胸水样本32份,非结核性胸水样本24份以及健康对照血清样本20份。结果单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示抗体类型为IgM、κ型,并可应用于Western blotting和免疫沉淀法。ELISA定量检测显示该特异性抗体检测结核分枝杆菌的敏感度为95.7%(67/70),特异度为100%(64/64)。结论 ESAT-6单克隆抗体用于结核分枝杆菌检测有较高的敏感性和特异性,可用于结核病的早期诊断。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 早期分泌性抗原靶蛋白6 抗原肽 单克隆抗体

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超滤浓缩脑脊液ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值 被引量：1

3

作者 黄刚 胡凡 +3 位作者 柴文 文安 刘诗英 吴晓牧 《实用临床医学（江西）》 CAS 2017年第8期25-26,28,共3页

目的探讨离心超滤技术浓缩脑脊液检查结核杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)在诊断结核性脑膜炎(TBM)中的价值。方法选取TBM患者40例(TBM组)和非TBM患者20例(非TBM组),每位患者留取2份脑脊液(一份为原液,另一份为离心超滤浓缩),使用EL... 目的探讨离心超滤技术浓缩脑脊液检查结核杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)在诊断结核性脑膜炎(TBM)中的价值。方法选取TBM患者40例(TBM组)和非TBM患者20例(非TBM组),每位患者留取2份脑脊液(一份为原液,另一份为离心超滤浓缩),使用ELlSA法检测其ESAT-6水平。结果 TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05),而非TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性与原液比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用离心超滤浓缩技术能提高脑脊液ESAT-6检查的敏感性,且操作简单,可作为快速诊断TBM的参照指标。 展开更多

关键词 结核性脑膜炎 早期分泌性抗原靶蛋白-6 超滤浓缩 免疫组织化学 脑脊液 诊断

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人乳头瘤病毒58型截短型L1蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6的融合表达及其抗血清的制备

4

作者 朱攀 井申荣 +1 位作者 曾韦锟 黄芬 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第4期534-538,共5页

目的原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1(Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清。方法利用PCR技术分别从HPV基因... 目的原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1(Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清。方法利用PCR技术分别从HPV基因组DNA和ESAT-6-18T质粒DNA中扩增tL1和ESAT-6基因,构建重组原核表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a,分别转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白ESAT-6-tL1经镍离子亲和层析柱纯化后免疫昆明小鼠,ELISA检测血清抗体效价。结果 PCR扩增出750 bp的tL1基因片段和320 bp的ESAT-6基因片段,测序结果与GenBank登录的序列一致;重组表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a经双酶切鉴定,构建正确;表达的ESAT-6-tL1融合蛋白相对分子质量约40 000,在E.coli Rosetta中的表达形式为包涵体,纯化后纯度为85%,免疫小鼠血清抗体效价为1:4 000。结论成功表达了ESAT-6-tL1融合蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研制检测HPV58的抗体奠定了基础。 展开更多

关键词 人乳头瘤病毒58型 截短型L1蛋白 结核分枝杆菌 早期分泌型抗原靶蛋白-6 融合表达 抗血清

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胸水单核细胞内早期分泌抗原靶蛋白6在结核性胸膜炎诊断中的价值 被引量：6

5

作者 黄秋生 陈惠芬 +3 位作者 高爱霞 王俊 黄茂 杨明夏 《中华医院感染学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期2727-2729,共3页

目的检测患者胸水单核细胞内早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6),探讨其在结核性胸膜炎诊断中的临床价值。方法应用免疫细胞化学染色法对2014年1月-2015年4月42例结核性胸膜炎及20例非结核性胸膜炎患者胸水单核细胞内ESAT-6进行检测,数据采用S... 目的检测患者胸水单核细胞内早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6),探讨其在结核性胸膜炎诊断中的临床价值。方法应用免疫细胞化学染色法对2014年1月-2015年4月42例结核性胸膜炎及20例非结核性胸膜炎患者胸水单核细胞内ESAT-6进行检测,数据采用SPSS17.0软件进行统计分析。结果胸水单核细胞中ESAT-6检测阳性率结核性胸膜炎患者为95.24%,显著高于非结核性胸膜炎患者的5.00%,两组患者ESAT-6检测阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.01);检测胸水单核细胞内ESAT-6诊断结核性胸膜炎的敏感度为95.23%,特异度为95.00%,阳性预测值为97.56%,阴性预测值为90.48%,阳性似然比为19.05,阴性似然比为0.05,约登指数为0.90。结论检测胸水单核细胞内ESAT-6对于诊断结核性胸膜炎具有灵敏度及特异性高,为诊断结核性胸膜炎的可行方法。 展开更多

关键词 胸水 单核细胞 早期分泌抗原靶蛋白6 结核性胸膜炎

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结核感染T细胞斑点试验在鉴别结核性与恶性胸腔积液中的价值研究 被引量：5

6

作者 王景民 马曼曼 高孟秋 《陕西医学杂志》 CAS 2021年第9期1147-1149,1153,共4页

目的:探究结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在鉴别结核性和恶性胸腔积液中的价值。方法:选取胸腔积液患者407例为研究对象,分为结核性胸腔积液组(328例)和恶性肿瘤胸腔积液组(79例)。比较两组患者胸腔积液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB... 目的:探究结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在鉴别结核性和恶性胸腔积液中的价值。方法:选取胸腔积液患者407例为研究对象,分为结核性胸腔积液组(328例)和恶性肿瘤胸腔积液组(79例)。比较两组患者胸腔积液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB检测结果及胸腔积液与外周血T-SPOT.TB差值。通过受试者工作特征曲线(ROC)分析胸腔积液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB及胸腔积液与外周血T-SPOT.TB差值对结核性和恶性肿瘤胸腔积液的鉴别诊断效能。结果:结核性胸腔积液组胸腔积液中早期分泌抗原靶蛋白-6(ESAT-6)、培养滤液蛋白-10(CFP-10)及ESAT-6+CFP-10斑点形成细胞(SFC)数量高于恶性肿瘤胸腔积液组(均P<0.05)。结核性胸腔积液组外周血中ESAT-6、CFP-10及ESAT-6+CFP-10 SFC数量高于恶性肿瘤胸腔积液组(均P<0.05)。结核性胸腔积液组胸腔积液ESAT-6+CFP-10与外周血ESAT-6+CFP-10 SFC数量差值高于恶性肿瘤胸腔积液组(P<0.05)。ROC曲线分析显示,胸腔积液T-SPOT.TB检测结果曲线下面积(AUC)高于外周血T-SPOT.TB。结论:胸腔积液较外周血T-SPOT.TB对结核性胸腔积液的辅助诊断价值更高。胸腔积液T-SPOT.TB与外周血T-SPOT.TB检测结果差值对鉴别结核性胸膜积液和恶性胸腔积液有较高辅助诊断价值。 展开更多

关键词 结核性胸腔积液 恶性胸腔积液 结核感染T细胞斑点试验 早期分泌抗原靶蛋白-6 培养滤液蛋白-10

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脑脊液单核细胞内ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值 被引量：5

7

作者 杨笑 郭旻 谢鹏 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期330-333,共4页

目的通过检测结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)患者脑脊液单核细胞中的早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target,ESAT-6),探讨ESAT-6在TBM诊断中的价值。方法将42例TBM患者与47例对照组患者进行脑脊液生化、细胞... 目的通过检测结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)患者脑脊液单核细胞中的早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target,ESAT-6),探讨ESAT-6在TBM诊断中的价值。方法将42例TBM患者与47例对照组患者进行脑脊液生化、细胞学、抗酸染色检查,同时用免疫荧光细胞化学染色法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6。结果在临床诊断TBM的42例患者中有38例脑脊液单核细胞中检出ESAT-6,47例对照组中检出4例。TBM组ESAT-6的检出率明显高于对照组(P<0.05)。该方法诊断TBM的敏感性为90.48%,特异性为91.49%。约登指数达到0.82。结论检测脑脊液单核细胞内结核特异性抗原ESAT-6用于诊断TBM,具有灵敏度、特异度高的特点,而且简单易行,有望成为诊断TBM的一种新的辅助方法。 展开更多

关键词 结核性脑膜炎 脑脊液 早期分泌抗原靶蛋白6

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呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化 被引量：1

8

作者 岳婷婷 井申荣 +1 位作者 曾韦锟 黄芬 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第3期324-327,共4页

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌... 目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。 展开更多

关键词 呼吸道合胞病毒 F2蛋白 分枝杆菌 结核 早期分泌抗原靶6蛋白 融合蛋白 表达 纯化

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增强ESAT6-CFP10融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答佐剂的筛选

9

作者 由鹏飞 叶祥忠 +2 位作者 葛胜祥 李益民 张怡轩 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第12期1607-1610,共4页

目的筛选能增强特异性抗原早期分泌抗原靶6蛋白(Early secretory antigenic target 6,ESAT6)-培养滤出液蛋白-10(Culture filtrate protein 10,CFP-10)融合蛋白(E1C0)诱导小鼠细胞免疫应答的佐剂,建立基于细胞免疫应答的小鼠模型,以评... 目的筛选能增强特异性抗原早期分泌抗原靶6蛋白(Early secretory antigenic target 6,ESAT6)-培养滤出液蛋白-10(Culture filtrate protein 10,CFP-10)融合蛋白(E1C0)诱导小鼠细胞免疫应答的佐剂,建立基于细胞免疫应答的小鼠模型,以评价基于体外干扰素γ释放分析(IFNγrelease assay,IGRA)结核诊断方法中特异性刺激抗原E1C0的活性。方法建立小鼠IFNγ双抗体夹心SABC-ELISA检测系统,并验证系统的线性、灵敏度、重复性和特异性。将BALB/c小鼠随机分为7组:E1C0+单磷酸类脂A(Monophosphoryl lipid A,MPL)+双十八烷基二甲基溴化铵(Dimethyl dioctadecylammonium bromide,DDA)组、E1C0+DDA组、E1C0+MPL组、E1C0+弗氏不完全佐剂(IFA)组、E1C0组、生理盐水组和MPL+DDA联合组,每组6只,经小鼠后肢内侧皮下免疫3次,间隔2周,免疫剂量为:E1C0 100μg/只,MPL 25μg/只,DDA 250μg/只,IFA 100μl/只。末次免疫4周后处死小鼠,无菌取脾,分离脾淋巴细胞,加入E1C0进行培养,MTT法检测特异性淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测培养上清中IFNγ水平。采用筛选出的最佳佐剂与抗原组合免疫3批BALB/c小鼠,进行IFNγ诱生测定。结果检测系统的线性范围为:40～2 560 pg/ml(R>0.98);灵敏度为40 pg/ml;变异系数(CV)<15%,检测大鼠、豚鼠和兔血清IFNγ均为阴性;E1C0+MPL+DDA组、E1C0+IFA组和E1C0+DDA组小鼠特异性淋巴细胞增殖刺激指数均明显高于生理盐水组(P<0.01);E1C0+MPL+DDA组小鼠的脾淋巴细胞经E1C0体外刺激后,产生的IFNγ水平明显高于其他组(P<0.001);重复试验结果显示,E1C0+MPL+DDA组3批小鼠免疫后,脾淋巴细胞诱生的IFNγ水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 E1C0与MPL和DDA联合免疫所诱导的小鼠Th1型细胞免疫应答最强,成功建立了用于评价刺激抗原E1C0活性的小鼠模型。 展开更多

关键词 结核杆菌 早期分泌抗原靶6蛋白 培养滤出液蛋白-10 融合蛋白 佐剂 干扰素

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结核分枝杆菌早期分泌靶抗原和抗原85B融合蛋白的原核表达及其在血清学检测中的初步应用 被引量：5

10

作者 石洁 朱岩昆 +4 位作者 马晓光 王少华 李辉 邢进 闫国蕊 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第5期389-392,396,共5页

目的原核表达结核分枝杆菌抗原早期分泌抗原靶6ku蛋白和抗原85B融合蛋白,建立融合抗原对结核病人快速诊断方法。方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中PCR扩增ag85B和Rv3875基因并构建表达载体pGEX4T-1上,转化BL21经IPTG诱导表达GST-85B-EST... 目的原核表达结核分枝杆菌抗原早期分泌抗原靶6ku蛋白和抗原85B融合蛋白,建立融合抗原对结核病人快速诊断方法。方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中PCR扩增ag85B和Rv3875基因并构建表达载体pGEX4T-1上,转化BL21经IPTG诱导表达GST-85B-ESTA-6融合蛋白,对包涵体进行变性和透析复性后进行GST亲和层析纯化,纯化的可溶性目的蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行鉴定;以融合蛋白为抗原,采用ELISA检测结核病人血清抗体。结果成功构建了结核分枝杆菌ag85B和Rv3875融合基因原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了高水平的GST-85B-ESTA-6,该蛋白存在于菌体沉淀中,以包涵体形式居多。包涵体经变性、复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白仍能与结核病患者血清反应,即可用于病人血清抗体检测。结论成功构建了pGEX4T-1-ag85B-Rv3875重组质粒,并诱导表达了含有GST-标签的ESAT-6-85B融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 早期分泌抗原靶6ku蛋白 抗原85 原核表达

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结核分枝杆菌EsxV亚单位疫苗黏膜免疫诱导的免疫应答 被引量：2

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作者 白鹭 宁唤唤 +6 位作者 康健 梁璇 谢燕玲 彭钰君 张婧瑶 路延之 柏银兰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期379-386,共8页

目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。... 目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。以EsxV和/或联合环二腺苷酸(c-di-AMP)经鼻黏膜免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠特异性抗体水平及亚类,MTS法检测脾细胞增殖,qRT-PCR检测脾和肺脏细胞因子表达水平,ELISA法检测脾细胞因子分泌水平。结果成功构建EsxV的原核表达载体pET28a(+)-esxV并诱导表达目的蛋白,亲和层析法获得了纯化的重组EsxV蛋白。EsxV经黏膜免疫可诱导显著的体液免疫应答,但诱导的细胞免疫应答水平不高。EsxV与c-di-AMP经黏膜接种可诱导特异性IgG水平增加,EsxV蛋白特异的脾细胞增殖,脾和肺细胞的IFN-γ转录增加。c-di-AMP显著提高EsxV特异的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17细胞因子分泌,而不诱导炎症因子TNF-α和IL-6表达。结论EsxV与c-di-AMP佐剂构建的亚单位疫苗可诱导特异性体液和细胞免疫应答,可进一步用于新型结核病亚单位疫苗的研制。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 6kDa早期分泌靶抗原分泌系统蛋白V(EsxV) 亚单位疫苗 黏膜免疫 环二腺苷酸

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