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分枝杆菌转化甾醇过程的中心代谢关键基因转录差异分析
1
作者 熊亮斌 孙吉 +4 位作者 刘显舟 屈占国 计雨情 徐一新 王风清 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期120-127,共8页
为探究新金色分枝杆菌代谢甾醇积累甾体药物中间体过程的中心代谢调节机制,采用转录组测序结合qRT-PCR技术,对比分析甾药中间体生产菌株中心代谢的关键基因转录水平,测定转化过程的葡萄糖消耗速率。结果显示,糖酵解途径的pfkB、pyk转录... 为探究新金色分枝杆菌代谢甾醇积累甾体药物中间体过程的中心代谢调节机制,采用转录组测序结合qRT-PCR技术,对比分析甾药中间体生产菌株中心代谢的关键基因转录水平,测定转化过程的葡萄糖消耗速率。结果显示,糖酵解途径的pfkB、pyk转录下调1.96倍及1.49倍;磷酸戊糖途径的zwf、gntZ转录下调3.57倍及2.43倍;三羧酸循环的citA、icd2和kdg转录分别下调2.5倍、1.78倍及1.92倍。对葡萄糖消耗速率的测定显示,中间体生产菌株的初始代谢速率显著低于野生型菌株。研究结果表明在转化甾醇积累甾药中间体过程中,分枝杆菌的中心代谢途径受到一定程度的抑制性调节。 展开更多
关键词 新金色分枝杆菌 甾体药物中间体 中心代谢 9-OHAD 葡萄糖
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新金色分枝杆菌ksd D基因的敲除及其对菌株AD(D)合成的影响
2
作者 韩冷 田灵芝 +3 位作者 马正 徐美娟 夏海锋 饶志明 《工业微生物》 CAS CSCD 2011年第4期37-42,共6页
新金色分枝杆菌（Mycobacteriumneoaurum）能将植物甾醇转化为药物中间体4-烯-雄甾-3，17-二酮（AD）和1，4-二烯-雄甾-3，17-二酮（ADD），其中3-甾酮-△1-脱氢酶（KSDD）是AD转化为ADD的关键酶。本实验室在筛菌过程中筛选到-株能将甾... 新金色分枝杆菌（Mycobacteriumneoaurum）能将植物甾醇转化为药物中间体4-烯-雄甾-3，17-二酮（AD）和1，4-二烯-雄甾-3，17-二酮（ADD），其中3-甾酮-△1-脱氢酶（KSDD）是AD转化为ADD的关键酶。本实验室在筛菌过程中筛选到-株能将甾醇转化为AD（D）的菌株，经鉴定为M．neoaurum，本研究以该菌株为出发菌株，首先扩增出长度约1．7kb编码KSDD的ksdD基因全序列，在基因内部插入-段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因（Km），将得到的基因元件ksdD：：Km电转化M．neoaurum，通过PCR验证获得稳定遗传的ksdD基因缺失重组转化子。研究结果表明，与原始菌株相比，缺失株KSDD酶活下降了85％，AD产量相比提高了1倍，ADD产量下降了35．2％。该研究证实了ksdD基因编码的3-甾酮-△1-脱氢酶（KSDD）是AD转化ADD的关键酶，为进-步研究KSDD酶学性质及阐明AD合成ADD的代谢机理奠定基础。 展开更多
关键词 新金色分枝杆菌 3-甾酮-△1-脱氢酶 ksdD
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羟丙基-β-环糊精对新金色分枝杆菌合成ADD蛋白质组的影响
3
作者 吴丹 张显 +4 位作者 饶志明 邵明龙 陈亚玲 徐美娟 杨套伟 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1117-1121,共5页
新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum JC-12)可降解植物甾醇合成药物中间体雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD),由于植物甾醇的溶解度较低,因此在转化体系中添加羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为助溶剂.本次研究在HP-β-CD存在与否条件下... 新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum JC-12)可降解植物甾醇合成药物中间体雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD),由于植物甾醇的溶解度较低,因此在转化体系中添加羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为助溶剂.本次研究在HP-β-CD存在与否条件下利用二维凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOFMS)分离和鉴定新金色分枝杆菌蛋白质表达量的差异;再使用反转录实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对挑选出的5个与ADD合成相关的蛋白质编码基因进行转录水平分析.结果表明,2-DE图谱及质谱结果共鉴定到12个具有显著差异表达量的蛋白质点.其中,参与植物甾醇降解合成ADD途径的乙醇脱氢酶、烯酰-Co A水合酶、乙酰-Co A乙酰基转移酶、3α,7α,12α-三羟基-5β-胆甾-24-烯酰-Co A水合酶和4,5-9,10-双断裂-3-羟基-5,9,17三氧雄甾-1(10),2-二烯-4-酸酯水解酶的蛋白质表达量在羟丙基-β-环糊精存在条件下显著提高;参与糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢的乙二醛酶、3-氧代酰基-ACP合酶、3-酮脂酰-ACP还原酶、分支酸合酶、氮调节蛋白P-II和DNA结合蛋白的蛋白质表达量也有一定的提高,但磷酸甘油酸变位酶的蛋白质表达量有所下降.通过RT-q PCR分析的转录水平的变化情况与2-DE得到的蛋白水平的结果相符.综上所述,羟丙基-β-环糊精可促进降解植物甾醇合成ADD代谢途径及糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢途径相关酶的表达量. 展开更多
关键词 植物甾醇 羟丙基-Β-环糊精 新金色分枝杆菌 双向电泳 实时荧光定量PCR
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新金色分枝杆菌CRISPR基因编辑技术的构建及其初步应用
4
作者 林春 童丽珍 +5 位作者 杨套伟 邵明龙 张显 徐美娟 廖祥儒 饶志明 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期50-58,共9页
新金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12是一株用于转化植物甾醇合成甾体激素类药物中间体的重要菌株,传统的基因编辑方法效率低、周期长、操作复杂并且需带入抗性标签。近期CRISPR(clustered regularly interspaced short palindr... 新金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12是一株用于转化植物甾醇合成甾体激素类药物中间体的重要菌株,传统的基因编辑方法效率低、周期长、操作复杂并且需带入抗性标签。近期CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9系统在许多非模式菌株中成功应用为本研究提供了参考。作者结合非同源黏性末端连接(NHEJ)构建了应用于新金色分枝杆菌基因组编辑CRISPR-Cas系统,对Mycobacterium neoaurum JC-12基因组上催化雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)的3-甾酮-脱氢酶(KSDD)分别设计了敲除和转录激活的靶向sgRNA。结果显示成功敲除了ksdd基因并且突变菌株KSDD的酶活下降了80%,突变株发酵96 h的AD产量比原始菌株提高了30%,并且突变株未代谢产生ADD。转录调控结果显示,靶向-29位点相比于无靶向对照ksdd的转录水平下降了38%,而靶向-83位点和-141位点则对ksdd的转录水平分别提升了2.24倍和3.23倍,同时对应的AD和ADD的产量在对-29位点激活时没有显著变化,而AD和ADD的产量在-83位点分别提升了26%和25%,在-141位点分别提升了29.5%和36%。以上研究为进一步对新金色分枝杆菌基因组水平的代谢工程改造提供了更便捷的方式。 展开更多
关键词 新金色分枝杆菌 CRISPR 基因编辑 转录激活
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