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3种灵长类动物SAGE1与INTS3相互作用保守性的验证
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作者 李晓畅 李明月 +1 位作者 雷鸣 武健 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期444-453,共10页
目的·研究恒河猴(Rhesus)、狨猴(Marmoset)、倭狐猴(Mouse Lemur)这3种代表性灵长类动物的癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)家族成员之一的肉瘤抗原1(sarcoma antigen 1,SAGE1)的进化,及其与整合体复合物(integrator comple... 目的·研究恒河猴(Rhesus)、狨猴(Marmoset)、倭狐猴(Mouse Lemur)这3种代表性灵长类动物的癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)家族成员之一的肉瘤抗原1(sarcoma antigen 1,SAGE1)的进化,及其与整合体复合物(integrator complex,INT)亚基INTS3之间的相互作用的保守性。方法·首先在HEK293T细胞中利用免疫共沉淀(coimmunoprecipitation,Co-IP)的方法验证3种灵长类动物的SAGE1和INTS3相互作用。随后在互作蛋白截短的片段上分别添加His-SUMO和GST标签,并在大肠埃希菌中进行表达,经过系列纯化步骤得到目标蛋白。通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)实验测定目标蛋白之间的结合强弱,借助广角激光散射凝胶排阻层析(size exclusion chromatographywithmulti-anglelightscattering,SEC-MALS)技术检测复合物的结合比例,并利用分子对接技术预测SAGE1和INTS3截短体的结合模型。分析人类INTS3和SAGE1互作界面,挑选在灵长类中也相对保守的关键互作氨基酸位点,将其突变后再次使用Co-IP分析INTS3和SAGE1的结合情况。结果·通过Co-IP方法,确定3种灵长类动物中INTS3和SAGE1全长蛋白之间存在相互作用。截短体蛋白经过外源诱导表达和多步纯化,获得高纯度蛋白样品;经过SPR对其进行结合和解离检测分析,得到了它们的解离常数在微摩尔级别;并且SEC-MALS结果显示INTS3与SAGE1的结合比例为2∶1。使用分子对接预测SAGE1和INTS3截短体结合模型,发现该复合物具有典型的“蝴蝶型结构”,由INTS3二聚体组成“蝴蝶身体”,由SAGE1组成“蝴蝶头部”,结合界面中疏水相互作用构成了主要的互作模式。分析突变后的SAGE1与INTS3全长蛋白相互作用,它们之间的结合明显减弱。结论·恒河猴、狨猴、倭狐猴中INTS3与SAGE1存在相互作用,并且相互作用具有高度的保守性。 展开更多
关键词 肉瘤抗原1 整合体复合物亚基3 相互作用
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