目的建立microRNA失功能(loss of function)研究模型,为功能研究提供实验材料。方法针对miR-483-5p成熟体序列设计含6个拷贝反义序列的DNA片段,称为"S-483",将其连接入含CAG启动子的pCAGGs载体中,构建pCAGGs-S-483重组质粒。...目的建立microRNA失功能(loss of function)研究模型,为功能研究提供实验材料。方法针对miR-483-5p成熟体序列设计含6个拷贝反义序列的DNA片段,称为"S-483",将其连接入含CAG启动子的pCAGGs载体中,构建pCAGGs-S-483重组质粒。利用脂质体技术瞬时转染Hep1-6细胞,经re-al-time PCR对成熟miR-483-5p含量进行检测。结果转染pCAGGs-S-483组miRNA-483含量(0.33±0.04)较转染空质粒组(1.00)明显下降(P<0.01),但对其它miRNAs无影响。结论 S-483海绵策略可有效"吸附"并降低miR-483-5p,成功构建了pCAGGs-S-483重组质粒,为其功能研究和miRNA敲减动物的建立提供了有益借鉴。展开更多
目的构建KLF2过表达BGC823和KLF2敲减MGC803胃癌稳转细胞株。方法克隆人源KLF2基因,连接到Age I/Age I酶切后GV358载体上,构建GV358-KLF2重组质粒,转染293T细胞,包装慢病毒;构建KLF2shRNA,连接到Bam HI和EcoRI双酶切后的PHBLV-U6-ZSGree...目的构建KLF2过表达BGC823和KLF2敲减MGC803胃癌稳转细胞株。方法克隆人源KLF2基因,连接到Age I/Age I酶切后GV358载体上,构建GV358-KLF2重组质粒,转染293T细胞,包装慢病毒;构建KLF2shRNA,连接到Bam HI和EcoRI双酶切后的PHBLV-U6-ZSGreen-Puro载体上,经鉴定后转染293T细胞。采用RT-PCR及Western印迹法检测稳转细胞株中KLF2的表达。结果利用慢病毒介导,重组质粒G V358-K L F2和K L F2-shRN A转导入B G C823细胞、M G C803细胞并稳定表达。RT-PC R和W estern印迹法结果均显示过表达稳转株KLF2表达量明显升高(P<0.05),敲减稳转株KLF2表达量明显下降(P<0.05)。结论成功构建了K L F2过表达B G C823细胞株和K L F2敲减M G C803细胞株,为后续K L F2功能实验奠定了基础。展开更多
基金supported by grants from the National Natural Science Foundation of China(No.31871508,31960158,31671560)Major Projects of Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region(No.2019ZD008)+3 种基金Open Project of the State Key Laboratory of Reproductive Regulation & Breeding of Grassland Livestockthe Funding of Top Disciplines DevelopmentGraduates Student Innovation Projects in Inner Mongolia Autonomous RegionGraduates Student Innovation Projects in Inner Mongolia University.
文摘目的建立microRNA失功能(loss of function)研究模型,为功能研究提供实验材料。方法针对miR-483-5p成熟体序列设计含6个拷贝反义序列的DNA片段,称为"S-483",将其连接入含CAG启动子的pCAGGs载体中,构建pCAGGs-S-483重组质粒。利用脂质体技术瞬时转染Hep1-6细胞,经re-al-time PCR对成熟miR-483-5p含量进行检测。结果转染pCAGGs-S-483组miRNA-483含量(0.33±0.04)较转染空质粒组(1.00)明显下降(P<0.01),但对其它miRNAs无影响。结论 S-483海绵策略可有效"吸附"并降低miR-483-5p,成功构建了pCAGGs-S-483重组质粒,为其功能研究和miRNA敲减动物的建立提供了有益借鉴。
文摘目的构建KLF2过表达BGC823和KLF2敲减MGC803胃癌稳转细胞株。方法克隆人源KLF2基因,连接到Age I/Age I酶切后GV358载体上,构建GV358-KLF2重组质粒,转染293T细胞,包装慢病毒;构建KLF2shRNA,连接到Bam HI和EcoRI双酶切后的PHBLV-U6-ZSGreen-Puro载体上,经鉴定后转染293T细胞。采用RT-PCR及Western印迹法检测稳转细胞株中KLF2的表达。结果利用慢病毒介导,重组质粒G V358-K L F2和K L F2-shRN A转导入B G C823细胞、M G C803细胞并稳定表达。RT-PC R和W estern印迹法结果均显示过表达稳转株KLF2表达量明显升高(P<0.05),敲减稳转株KLF2表达量明显下降(P<0.05)。结论成功构建了K L F2过表达B G C823细胞株和K L F2敲减M G C803细胞株,为后续K L F2功能实验奠定了基础。
