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活菌核酸微定量技术评价抗菌药物对胞内鲍曼不动杆菌感染的影响
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作者 翁邦碧 李玉良 +1 位作者 罗丹 枉前 《中国药业》 CAS 2023年第11期33-38,共6页
目的建立测定细胞内活菌含量的活菌核酸微定量技术,考察临床常用抗菌药物对胞内鲍曼不动杆菌感染的影响。方法采用抗菌药物-病原菌-上皮细胞共培养模型,以改良叠氮溴化丙锭-实时荧光定量聚合酶链反应(PMAxx-qPCR)法测定不同种类和不同... 目的建立测定细胞内活菌含量的活菌核酸微定量技术,考察临床常用抗菌药物对胞内鲍曼不动杆菌感染的影响。方法采用抗菌药物-病原菌-上皮细胞共培养模型,以改良叠氮溴化丙锭-实时荧光定量聚合酶链反应(PMAxx-qPCR)法测定不同种类和不同浓度的抗菌药物对鲍曼不动杆菌侵袭人支气管上皮(HBE)细胞形成胞内菌数量的影响;显微镜下观察0.1倍最低抑菌浓度(MIC)庆大霉素对绿色荧光蛋白融合鲍曼不动杆菌(AB-GFP)侵袭HBE细胞的影响。结果与对照组比较,经0.1倍、1倍、10倍MIC的阿奇霉素、左氧氟沙星、头孢哌酮舒巴坦、替加环素,以及10倍、1倍MIC的多西环素、庆大霉素干预的鲍曼不动杆菌侵袭HBE细胞形成胞内菌的数量均显著降低(P<0.001);经0.1倍MIC的庆大霉素干预的胞内鲍曼不动杆菌的数量均显著升高(P<0.001)。在0.1倍MIC的庆大霉素作用下,AB-GFP侵袭进入HBE细胞的量显著增加。结论0.1倍、1倍、10倍MIC的阿奇霉素、左氧氟沙星、头孢哌酮舒巴坦、替加环素、庆大霉素、多西环素均不能有效杀灭胞内菌。该方法操作简便、结果准确,能快速地测定胞内鲍曼不动杆菌的浓度,可用于评价抗菌药物对胞内鲍曼不动杆菌感染的影响,以及胞内鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性。 展开更多
关键词 鲍曼不动杆菌 胞内菌 改良叠氮溴化丙锭 实时荧光定量聚合酶链反应 最低抑菌浓度 抗菌药物
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芸薹根肿菌活细胞PMAxx-qPCR快速定量检测方法的建立与应用 被引量：1
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作者 李晓菁 张思雨 +8 位作者 刘迪 袁晓伟 李兴盛 石延霞 谢学文 李磊 范腾飞 李宝聚 柴阿丽 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1938-1948,共11页
【目的】由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的十字花科根肿病是一种世界性土传病害,病原菌长期存在于土壤中,对十字花科作物造成严重威胁。改良叠氮溴化丙锭(propidium monoazide xx,PMAxx)可选择性地穿透受损的死细胞膜... 【目的】由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的十字花科根肿病是一种世界性土传病害,病原菌长期存在于土壤中,对十字花科作物造成严重威胁。改良叠氮溴化丙锭(propidium monoazide xx,PMAxx)可选择性地穿透受损的死细胞膜,并抑制死细胞DNA的实时荧光定量PCR(qPCR)扩增。本文将PMAxx与qPCR技术相结合,建立一种快速检测芸薹根肿菌活菌的方法,为根肿病的早期诊断及制定科学的防控措施提供依据。【方法】配置浓度分别为0、5、10、20、40、60μmol·L^(-1)的叠氮溴化丙锭PMA和改良叠氮溴化丙锭PMAxx,比较两种核酸染料对芸薹根肿菌死细胞DNA扩增的抑制效果,确定最佳核酸染料及工作浓度;设置光照时间分别为0、2、5、10、15和20 min,进行最佳光照时间的优化,建立芸薹根肿菌活细胞PMAxx-qPCR快速检测体系。设置芸薹根肿菌活孢子百分比为0、0.01%、0.1%、1%、10%、25%、50%、75%和100%的混合体系,验证PMAxx-qPCR体系的准确性,并应用于田间土壤样本中芸薹根肿菌活孢子的定量检测。【结果】PMAxx对芸薹根肿菌死细胞DNA的扩增抑制效果更好,当芸薹根肿菌浓度为1×10^(8)个孢子/mL,PMAxx预处理的最适终浓度为4μmol·L^(-1),最佳光照时间为10 min时,可有效地抑制死孢子DNA的扩增,仅以有活力孢子DNA为靶标选择性地扩增。利用PMAxx-qPCR技术检测已知不同活孢子比例的菌悬液样品,各样品实测孢子存活率和理论存活率之间呈正相关(R^(2)=0.992)。对田间采集的25份土壤样本,采用PMAxx-qPCR方法检测到11份样本中携带芸薹根肿菌,活细胞DNA浓度为32.35-6.97×10^(3)fg·g^(-1)。【结论】建立了基于PMAxx-qPCR的芸薹根肿菌活细胞定量检测技术,该技术具有快速、准确、灵敏的特点,解决了qPCR不能仅对活体病原菌进行准确鉴别和定量分析的问题,为制定有效的根肿病防控策略提供了依据。 展开更多
关键词 芸薹根肿菌 根肿病 改良叠氮溴化丙锭 实时荧光定量PCR 活性孢子
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