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牛结核分枝杆菌ESAT6-CFP10-BFH融合蛋白原核表达及皮试反应
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作者 鲍佳鹏 孙悦 +9 位作者 张建军 苏岳乐 毕力格 郭宇 巴依尔塔 赵东辉 陈彪 冯紫佳 郑可 秦建华 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期2502-2508,共7页
为了改善ESAT6-CFP10融合蛋白检测牛结核分枝杆菌感染存在灵敏度低的问题,应用铁蛋白骨架显著性提升EC(ESAT6-CFP10)法的灵敏度,将ESAT6、CFP10和牛源铁蛋白重链(BFH)用柔性多肽连接,按照ESAT6-CFP10-BFH的串联组合方案设计基因序列,构... 为了改善ESAT6-CFP10融合蛋白检测牛结核分枝杆菌感染存在灵敏度低的问题,应用铁蛋白骨架显著性提升EC(ESAT6-CFP10)法的灵敏度,将ESAT6、CFP10和牛源铁蛋白重链(BFH)用柔性多肽连接,按照ESAT6-CFP10-BFH的串联组合方案设计基因序列,构建pET-28a-EC-BFH重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。使用自诱导培养基对铁蛋白EC融合抗原(EC-BFH蛋白)进行诱导表达,亲和层析镍柱法纯化EC-BFH蛋白,使用蛋白印迹(Western blot)对EC-BFH蛋白进行鉴定及纯度测定。将EC-BFH蛋白对健康豚鼠进行皮试,通过观察皮试部位是否会引起炎性反应,验证EC-BFH蛋白的特异性。对牛结核分枝杆菌致敏成功的豚鼠,以提纯牛型结核菌素(PPDB)作为对照,检测EC蛋白和EC-BFH蛋白效价对比阳性率。结果表明:EC-BFH蛋白的相对分子质量约为48.4 kDa,与预期相同,说明成功纯化EC-BFH蛋白。EC-BFH蛋白对健康豚鼠进行皮试24 h后无炎症反应,说明EC-BFH蛋白特异性良好。根据阳性率数据显示EC-BFH蛋白效价远远高于EC蛋白;在注射量为1,10和20μg时,EC-BFH蛋白皮试的阳性率均高于EC蛋白,尤其注射量在1μg时,EC蛋白和EC-BFH蛋白的阳性率分别为16.6%和100%,且EC-BFH蛋白与PPDB的阳性率接近。结果表明EC-BFH融合蛋白提高了EC法检测牛结核分枝杆菌感染的灵敏度,增强了皮试反应效果,作为检测牛结核分枝杆菌感染的诊断试剂有很大的研究价值。 展开更多
关键词 ESAT6-CFP10融合蛋白 牛结核分枝杆菌 提纯牛型结核菌素
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