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表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用 被引量：4
1
作者 张晓战 杨磊 +8 位作者 邓同炜 赵攀登 彭志锋 陈露露 郭懿文 夏艳勋 乔宏兴 边传周 王增 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期2978-2985,共8页
塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在... 塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在实验室前期对SVA研究的基础上建立稳定表达绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒,为体外高通量筛选具有抗SVA活性药物提供一种简单快速有效的工具。本研究在pEGFP-C1载体EGFP基因末端引入猪捷申病毒1型的2A基因,构建EGFP-P2A融合基因过度质粒,随后分别设计带有同源臂的克隆引物,通过同源重组技术将EGFP-P2A基因插入SVA毒株CH/HeN-2018基因组2A和2B基因间,并经测序鉴定,成功构建重组载体pSVA-EGFP。将pSVA-EGFP转染PK-15细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的重组SVA荧光毒rCH/HeN-2018-EGFP。通过绿色荧光观察、RT-PCR和生长曲线测定,评估了重组毒株rCH/HeN-2018-EGFP和亲本毒株生长特性。并进一步通过药物细胞毒性试验和病毒感染试验对rCH/HeN-2018-EGFP作为潜在抗SVA药物筛选工具进行评价。结果表明,rCH/HeN-2018-EGFP与亲本毒株wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在PK-15细胞中具有相似的生长特性,且遗传稳定,在P10代能够稳定表达绿色荧光,插入的EGFP-P2A基因没有出现突变现象。抗SVA病毒感染试验结果表明,用终浓度20μmol·L^(-1)的姜黄素和110μmol·L^(-1)黄芩苷预处理PK-15细胞2 h,通过观察荧光细胞的数量直观判断两种药物均能够抑制rCH/HeN-2018-EGFP在细胞中的复制,其中黄芩苷抑制效果极显著。随后在亲本毒株wtCH/HeN-2018感染试验进一步证实了黄芩苷对SVA病毒复制抑制的效果。本研究所构建的携带EGFP基因的重组SVA毒株能够高效稳定地表达绿色荧光蛋白,可以作为一种工具报告病毒应用于抗SVA药物和蛋白的筛选过程。 展开更多
关键词 塞内卡病毒 反向遗传操作系统 报告病毒 绿色荧光蛋白 抗病毒药物筛选
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表达绿色荧光蛋白的坦布苏病毒的构建与鉴定
2
作者 章丽娇 田宇杰 +9 位作者 张兰香 赵冬敏 韩凯凯 黄欣梅 杨婧 吴凤瑶 刘青涛 刘宇卓 张小飞 李银 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期44-50,共7页
报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′... 报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′UTR间引入外源基因EGFP,通过融合PCR获得全长cDNA PCR产物,体外转录生成mRNA,转染至BHK-21拯救重组病毒并研究其生长特性。结果显示,利用5′UTR-C位点构建的报告病毒mRNA转染BHK-21细胞后能观察到明显的绿色荧光;报告病毒P0接种DEF细胞后可高强度表达绿色荧光蛋白,在BHK-21和DEF细胞上增殖速度略微低于亲本毒株,但差异不显著。结果表明,成功构建了1株坦布苏绿色荧光报告病毒rJXSP-5′EGFP,在BHK-21和DEF细胞上均能有效增殖。 展开更多
关键词 坦布苏病毒 绿色荧光蛋白 报告病毒
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基于猪流行性腹泻病毒GⅡb亚型重组荧光病毒中和抗体检测方法的建立
3
作者 林莉莉 张梦迪 +5 位作者 朱琳琳 马海龙 孙琪 何启盖 张梦佳 李文涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1649-1660,共12页
2010年以来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)GⅡ型变异毒株的出现,导致全世界范围内猪流行性腹泻(PED)的病死率显著增加。疫苗免疫是PED有效防控的重要策略之一,疫苗诱导的中和抗体水平是免疫效果评价和疫苗质量评估的重要指标。然而,在Vero-CC... 2010年以来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)GⅡ型变异毒株的出现,导致全世界范围内猪流行性腹泻(PED)的病死率显著增加。疫苗免疫是PED有效防控的重要策略之一,疫苗诱导的中和抗体水平是免疫效果评价和疫苗质量评估的重要指标。然而,在Vero-CCL81上开展的PEDV经典中和试验中所添加的胰酶会导致试验结果不稳定等问题。本研究拟在构建稳定表达绿色荧光蛋白的重组病毒基础上,建立一种能准确评估样品中和抗体的检测方法。本研究在pUC57载体上克隆插入GⅡb亚型PEDV-GDU株部分ORF1a和ORF1b基因片段与其他结构基因片段,并通过无缝克隆技术将ORF3基因替换为EGFP基因,构建辅助质粒pUC57-PEDV-GDU-dORF3-EGFP,通过RNA定向重组技术拯救重组荧光病毒rPEDV-GDU-dORF3-EGFP。进一步通过间接免疫荧光试验(IFA)、Western blot和病毒生长曲线测定等方法,比较重组荧光病毒和亲本病毒生物学特性。最终利用重组荧光工具病毒筛选在不添加胰酶的条件下仍能支持PEDV有效增殖的细胞系,并建立中和试验方法。结果表明,成功拯救重组荧光病毒rPEDV-GDU-dORF3-EGFP,且在Vero-CCL81细胞上,重组荧光病毒与亲本病毒呈现相似的生物学特性。利用该重组荧光病毒筛选到一株亚克隆Huh7.10细胞可支持PEDV在无外源胰酶添加条件下的有效感染与复制。并利用Huh7.10细胞和重组荧光病毒成功建立了PEDV中和试验方法,相关性试验分析表明,该方法测定结果与ELISA抗体检测结果相关性高于PEDV经典中和试验。以上试验结果表明,本研究成功建立了PEDV-GDU毒株的反向遗传操作平台,为PED新型疫苗候选毒株的快速制备提供了有力的工具。此外,基于重组荧光病毒在Huh7.10细胞上建立的中和试验方法能更准确地测定血清中和抗体水平,为疫苗免疫效果的评估提供了有效的技术支持手段。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 反向遗传学 胰蛋白酶 报告病毒 中和试验
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鼠肝炎病毒A59毒株感染性克隆的构建及应用 被引量：1
4
作者 于尹 冯飞 +3 位作者 马艳龙 朱云凯 叶荣 张荣 《微生物与感染》 CAS 2022年第3期139-147,共9页
鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)是研究冠状病毒的模式病毒,但传统的病原学研究方法局限于自然界分离的病毒,不利于研究的开展。反向遗传操作系统可快速获得研究所需的重组病毒,为研究MHV及其他冠状病毒的基因组功能开辟了新途... 鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)是研究冠状病毒的模式病毒,但传统的病原学研究方法局限于自然界分离的病毒,不利于研究的开展。反向遗传操作系统可快速获得研究所需的重组病毒,为研究MHV及其他冠状病毒的基因组功能开辟了新途径。本研究通过反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)将MHV的原始毒株A59全长基因组分成6个片段进行扩增,分别克隆到质粒载体,经酶切、体外连接和转录获得全长基因组RNA,然后电转细胞并进行病毒扩增。结果显示,重组病毒rA59与原始毒株的复制特性相似,其为研究MHV的生物学特性提供了实验工具。为方便检测病毒的复制水平,在病毒基因组开放阅读框4(open reading frame 4,ORF4)内分别插入绿色荧光蛋白ZsGreen(Zoanthus sp.green fluorescent protein)和荧光素酶Nluc(NanoLuc luciferase)报告基因,获得rA59-ZsGreen和rA59-Nluc重组报告病毒。结果显示,报告病毒所携带的报告基因并不影响病毒复制,可很好地反映病毒的复制特性。使用这两种病毒验证瑞德西韦(remdesivir)的抗病毒活性,分别检测药物处理后病毒的荧光亮度和荧光素酶活性。结果表明,rA59-ZsGreen和rA59-Nluc重组报告病毒适用于高通量药物筛选,具有重要的应用前景。综上所述,本研究成功建立了MHV A59毒株六质粒反向遗传操作系统,为研究MHV的生物学特性和测试抗病毒药物等提供了有力的工具。 展开更多
关键词 鼠肝炎病毒 感染性克隆 病毒拯救 报告病毒
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H7N9禽流感荧光报告病毒的构建及初步应用
5
作者 于晓菲 万晓朋 +1 位作者 李继清 姜永萍 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期231-238,共8页
为实现对H7N9禽流感病毒(AIV)感染过程的动态可视化示踪,本研究构建了重组报告质粒pHH21-NS-Venus、pHH21-NS-Apple 和包含 H7N9 AIV CK/SD008 株的 8 个基因节段的重组质粒 pHH21-PB2-627E、pHH21-PB2-627K(来自 CK/SD008-627K 株)、pH... 为实现对H7N9禽流感病毒(AIV)感染过程的动态可视化示踪,本研究构建了重组报告质粒pHH21-NS-Venus、pHH21-NS-Apple 和包含 H7N9 AIV CK/SD008 株的 8 个基因节段的重组质粒 pHH21-PB2-627E、pHH21-PB2-627K(来自 CK/SD008-627K 株)、pHH21-PB1、pHH21-PA、pHH21-HA、pHH21-NA、pHH21-NP、pHH21-M。上述质粒均经测序鉴定。利用12质粒反向遗传操作系统,构建2株荧光报告病毒SD008-627EVenus、SD008-627E-Apple,及E627K 对哺乳动物嗜性的 2株荧光报告病毒 SD008-627K-Venus、SD008-627KApple。将这4株报告病毒感染A549细胞后在荧光显微镜下均可见相应荧光且病毒主要定位在细胞核中;将其中两株报告病毒SD008-627E-Venus/Apple经鸡胚传2代,2株SD008-627K-Venus/Apple在小鼠体内传3代后均感染A549细胞,经倒置荧光显微镜观察均可见相应荧光。上述结果表明4株报告病毒正确构建,且其可以在鸡胚或者小鼠体内传代(即SD008-627K-Venus/Apple为小鼠适应性报告病毒)。将4株报告病毒与亲本病毒分别感染C57BL/6小鼠,进行小鼠致病性试验。结果显示,报告病毒SD008-627E-Venus/Apple与其亲本病毒SD008-627E的MLD_(50)均>5 log_(10)EID_(50)/mL,且均对小鼠不致死;报告病毒SD008-627K-Venus/Apple与其亲本病毒SD008-627K的MLD_(50) 分别为1.6 log_(10)EID_(50)/mL、2.3 log_(10)EID_(50)/mL 和 1.8 log_(10)EID_(50)/mL;报告病毒 SD008-627E-Venus/Apple 与其亲本病毒SD008-627E感染小鼠的鼻甲、肺、脑、脾和肾的病毒滴度均<10^(2) EID_(50)/mL;SD008-627K-Venus/Apple及其亲本病毒SD008-627K的鼻甲和肺的病毒滴度均>10^(6) EID_(50)/mL,脑、脾和肾的病毒滴度均<102EID_(50)/mL。上述结果表明,构建的4株报告病毒均未改变亲本病毒对小鼠的致病性。利用噬斑试验,将报告病毒SD008-627K-Venus感染MDCK细胞,结果可见其能够引起细胞病变和表达荧光蛋白且荧光斑数量与噬斑数量相近。分别将报告病毒SD008-627K-Venus感染小鼠,3 d后取其肺脏研 展开更多
关键词 H7N9 报告病毒 荧光蛋白
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