大豆主要过敏原Gly m Bd 30K的抗原表位区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定 被引量：9

1

作者 林苏霞 王晓梅 +3 位作者 刘志刚 曾梦雅 吴研 陈家杰 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期186-190,共5页

根据文献并结合生物信息学方法选取大豆主要过敏原Gly m Bd 30k的抗原表位区,采用PCR方法扩增出该抗原表位区基因片段,并通过酶切连接分别构建单体的pET表达载体(pET-sGly)和二聚体的pET表达载体(pET-dGly),重组质粒转化到大肠杆菌BL21(... 根据文献并结合生物信息学方法选取大豆主要过敏原Gly m Bd 30k的抗原表位区,采用PCR方法扩增出该抗原表位区基因片段,并通过酶切连接分别构建单体的pET表达载体(pET-sGly)和二聚体的pET表达载体(pET-dGly),重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析;同时用Ni2+离子亲和层析柱纯化表达的sGly和dGly抗原表位蛋白,用western-blotting和ELISA检测重组蛋白的免疫原性。结果表明:表达的单体sGly蛋白以可溶性表达为主,而其二聚体dGly蛋白以包涵体形式存在,纯化的sGly和dGly蛋白都具有较好的免疫原性,重组蛋白sGly的抗原性更佳。成功构建的大豆主要过敏原Gly m Bd 30k蛋白的抗原表位区单体sGly蛋白及其二聚体dGly蛋白的工程菌,为研制大豆主要过敏原的单克隆抗体以制备用于大豆主要过敏原检测的试剂奠定了基础。 展开更多

关键词 大豆主要过敏原 GLY M BD 30k 抗原表位区 基因克隆

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鹅细小病毒单克隆抗体的制备及抗原表位区分析 被引量：3

2

作者 王娟 李艳莉 +3 位作者 厚华艳 王建业 陶洁 朱国强 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期1-5,共5页

采用杂交瘤细胞融合技术,获得3株能稳定分泌抗GPV特异性抗体的杂交瘤细胞株,免疫印迹结果表明:这3株单抗均能与纯化的GPV病毒子及重组VP3蛋白发生特异性反应,而与鸭肝炎病毒、鸭细小病毒、鹅源新城疫病毒无交叉反应。采用真核表达载体pC... 采用杂交瘤细胞融合技术,获得3株能稳定分泌抗GPV特异性抗体的杂交瘤细胞株,免疫印迹结果表明:这3株单抗均能与纯化的GPV病毒子及重组VP3蛋白发生特异性反应,而与鸭肝炎病毒、鸭细小病毒、鹅源新城疫病毒无交叉反应。采用真核表达载体pCAGGS对VP3基因进行分段克隆并转染COS-1细胞表达,用单抗介导的间接免疫荧光(IFA)进行检测,结果表明:3E8株单抗与VP3蛋白135～332氨基酸(aa)和322～535aa肽段均能发生特异反应,因此可以推定3E8株单抗识别的抗原表位在VP3的322～332aa上。 展开更多

关键词 鹅细小病毒 VP3蛋白 单克隆抗体 抗原表位区

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伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中的表达与gE乳胶凝集鉴别诊断方法的建立 被引量：1

3

作者 唐勇 陈焕春 +3 位作者 肖少波 覃雅丽 何启盖 任裕其 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期167-170,共4页

将伪狂犬病病毒 (PRV)Ea株 gE 基因主要抗原表位区段融合到原核表达载体 pET2 8b的T7启动子下游 ,构建成原核表达质粒 ,经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和Westernblot印迹分析 ,证实 gE 基因主要抗原表位区在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物具有... 将伪狂犬病病毒 (PRV)Ea株 gE 基因主要抗原表位区段融合到原核表达载体 pET2 8b的T7启动子下游 ,构建成原核表达质粒 ,经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和Westernblot印迹分析 ,证实 gE 基因主要抗原表位区在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物具有抗原性 ,分子量为 38kD ,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理 ,复性产物致敏乳胶 ,并对抗原致敏浓度、致敏时间、致敏温度进行优化 ,建立了gE乳胶凝集试验 (gE -LAT)。该方法不仅能显著区分 gE 基因缺失疫苗免疫猪血清和野毒感染猪血清 ,而且具有简便、快速等优点。检测临床 36 0份猪血清 ,阳性率为 5 7 78% (2 0 8/ 36 0 ) ,比国外阻断 gE -ELISA的 5 8 0 6 % (2 0 9/ 36 0 )略低 ,阳性符合率为 94 86 % (2 0 3/ 2 14 ) ,总符合率为 96 94 % (349/ 36 0 ) ,两种检测方法结果差异不显著 (P >0 0 5 )。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 GE基因 抗原表位区 大肠杆菌 表达 gE乳胶凝集 鉴别诊断方法

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伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立 被引量：3

4

作者 吉艺宽 王雨 +3 位作者 程艺 张宝石 向柯宇 琚春梅 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期11-15,共5页

【目的】为了区分伪狂犬病病毒疫苗免疫猪和自然感染猪,建立快速诊断的方法.【方法】利用PCR方法从伪狂犬病病毒中扩增出糖蛋白E(g E)基因的主要抗原表位区,用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒p... 【目的】为了区分伪狂犬病病毒疫苗免疫猪和自然感染猪,建立快速诊断的方法.【方法】利用PCR方法从伪狂犬病病毒中扩增出糖蛋白E(g E)基因的主要抗原表位区,用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒p ET-g E184,并转化至大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,用纯化后的g E184蛋白作为包被抗原,建立间接g E184-ELISA检测方法.【结果和结论】用该方法检测290份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为93.1%. 展开更多

关键词 伪狂犬病毒 GE基因 抗原表位区 原核表达 gE184-ELISA

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口蹄疫病毒非结构蛋白3AB单克隆抗体的制备及其对应表位区分析 被引量：1

5

作者 刘丹丹 高明春 +6 位作者 宋军 宋鸽 曹永生 张润祥 李爽 于力 王君伟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期733-737,共5页

为鉴定口蹄疫病毒(FMDV)的非结构蛋白3AB的抗原表位,本研究以原核表达并纯化的FMDV 3AB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,获得6株能够稳定分泌抗3AB蛋白特异性单克隆抗体(MAb)的杂... 为鉴定口蹄疫病毒(FMDV)的非结构蛋白3AB的抗原表位,本研究以原核表达并纯化的FMDV 3AB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,获得6株能够稳定分泌抗3AB蛋白特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞。这6株MAbs亚类鉴定均为IgG1型,轻链均为κ链。间接免疫荧光试验结果表明,这6株MAbs均能够识别FMDV 3AB蛋白。采用制备的MAb对分段表达的3AB蛋白进行western blot分析,结合位点分别位于3AB的第aa 55～aa 70、aa 64～aa 79、aa 130～aa 145区段。该结果为进一步探索3AB蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 非结构蛋白3AB 单克隆抗体 抗原表位区

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猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位区基因克隆、分析及原核表达

6

作者 肖建雄 唐志玲 罗满林 《广东畜牧兽医科技》 2013年第2期17-20,共4页

从患流行性腹泻的病猪小肠中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),设计一对引物用于扩增PEDV S蛋白的抗原表位区,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a,构建了重组表达质粒pET32a-PEDV-S1;在IPTG的诱导下表达,经SDS-PAGE分析,West ern bl ot t i... 从患流行性腹泻的病猪小肠中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),设计一对引物用于扩增PEDV S蛋白的抗原表位区,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a,构建了重组表达质粒pET32a-PEDV-S1;在IPTG的诱导下表达,经SDS-PAGE分析,West ern bl ot t i ng鉴定,结果表明该抗原表位区蛋白得到了重组表达。该研究可为PEDV抗原表位区的相关研究提供参考。 展开更多

关键词 PEDV S蛋白 抗原表位区 原核表达

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猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株S基因的克隆、序列分析及线性抗原表位区的鉴定 被引量：21

7

作者 孙东波 冯力 +4 位作者 陈建飞 时洪艳 佟有恩 刘胜旺 陈洪岩 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期224-229,共6页

以猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得的3个相互重叠的cDNA克隆覆盖了S基因,序列比对结果表明：PEDV CH/JL株S基因与CV777、Brl/87、JS、KPEDV和Chinju99毒株S基因核苷酸序列的同源性分别为96.97%、96.87%、96.41... 以猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得的3个相互重叠的cDNA克隆覆盖了S基因,序列比对结果表明：PEDV CH/JL株S基因与CV777、Brl/87、JS、KPEDV和Chinju99毒株S基因核苷酸序列的同源性分别为96.97%、96.87%、96.41%、94.02%和93.93%,氨基酸序列的同源性分别为96.17%、95.88%、96.10%、92.36%和92.05%;分子进化树分析结果显示,PEDV CH/JL株S基因与JS毒株S基因亲缘关系最近,处于同一群。利用DNAstar Protean程序预测了PEDV CH/JL株S蛋白一个抗原表位区（83-276aa）,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞,在终浓度1.0mmol/L的IPTG诱导下获得了表达,Western blot结果显示,预测的抗原表位区GST融合蛋白能与猪流行性腹泻病毒多克隆抗血清反应,提示该抗原表位区含有线性抗原表位。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 S基因 序列分析 线性抗原表位区

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伪狂犬病病毒gB基因的原核表达及间接ELISA方法的建立 被引量：7

8

作者 王雨 吉艺宽 +3 位作者 程艺 张宝石 向柯宇 琚春梅 《动物医学进展》 北大核心 2015年第6期19-23,共5页

为了建立评价伪狂犬病疫苗免疫效果的方法,应用PCR方法扩增gB基因的主要抗原表位区序列,大小为768bp,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pETgB768,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后,通过IPTG进行诱导表达,经SDS-P... 为了建立评价伪狂犬病疫苗免疫效果的方法,应用PCR方法扩增gB基因的主要抗原表位区序列,大小为768bp,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pETgB768,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后,通过IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测融合蛋白的表达情况及其反应原性。用纯化的gB768蛋白作为包被抗原建立间接gB768-ELISA检测方法,试验结果表明,该方法具有良好的敏感性、特异性、重复性。用该方法检测128份临床送检猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果进行比较,符合率为93.8%。该方法的建立为猪伪狂犬病疫苗免疫效果的评估奠定了基础。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 GB基因 主要抗原表位区 gB768-ELISA

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共表达TGEV AD蛋白和PEDV S蛋白CS区重组伪狂犬病病毒的构建及纯化

9

作者 赵丽 吕玉金 +3 位作者 徐通 许瑞勤 金钺 陈红英 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期237-243,共7页

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的CS中和表位区(499~789 aa)序列设计1对特异性引物,在其5′端分别引入BamHⅠ和HindⅢ,PCR扩增PEDV CS区。将扩增的CS片段插入至pBApo-EF1α_Pur_DNA真核表达载体的BamHⅠ和HindⅢ位点,然后扩增含CS区... 根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的CS中和表位区(499~789 aa)序列设计1对特异性引物,在其5′端分别引入BamHⅠ和HindⅢ,PCR扩增PEDV CS区。将扩增的CS片段插入至pBApo-EF1α_Pur_DNA真核表达载体的BamHⅠ和HindⅢ位点,然后扩增含CS区表达盒,将其插入至含猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)AD基因的PRV转移质粒pG-AD-EGFP中,构建转移质粒pG-AD-CS-EGFP。利用转染试剂ZLip2000将伪狂犬病病毒(PRV)三基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-/TK-基因组与转移质粒pG-AD-CS-EGFP共转染ST细胞,获得携带有TGEV AD、PEDV CS区和绿色荧光蛋白标记基因的重组病毒rPRV-AD-CS-EGFP。扩增重组病毒rPRV-AD-CS的表达盒,测序后进行遗传稳定性评价,同时将重组病毒rPRV-AD-CS、亲本株Bartha-K61和PRV强毒株分别接种小鼠,进行安全性评价。将该重组病毒与CRISPR/Cas9-EGFP敲除质粒共转染ST细胞,经3轮病毒空斑纯化获得无绿色荧光标记的重组病毒rPRV-AD-CS。经Western blot和IFA证实rPRV-AD-CS在ST细胞中能表达CS外源蛋白,具有良好的遗传稳定性和安全性。结果表明,成功构建共表达TGEV AD蛋白和PEDV S蛋白CS区的重组病毒株rPRV-AD-CS,该重组病毒具有遗传稳定性和安全性,为开发安全、有效的预防TGEV、PEDV和PRV感染的三联苗奠定基础。 展开更多

关键词 PEDV CS中和表位区 TGEV AD抗原表位区 PRV

原文传递

猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达 被引量：2

10

作者 冉旭华 孟凡 +2 位作者 闻晓波 单玉波 周恩民 《生物技术》 CAS CSCD 2008年第2期18-20,共3页

目的:用大肠杆菌表达猪细小病毒NS1基因的主要抗原表位区。方法:通过对GenBank发表的猪细小病毒(Porcine Par-vovirus,PPV)中国株非结构蛋白NS1的氨基酸序列分析,确定了其中抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,扩... 目的:用大肠杆菌表达猪细小病毒NS1基因的主要抗原表位区。方法:通过对GenBank发表的猪细小病毒(Porcine Par-vovirus,PPV)中国株非结构蛋白NS1的氨基酸序列分析,确定了其中抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,扩增出包含NS1主要抗原表位区的843bp的片段。酶切后连接到原核表达载体pET30a(+)上,构建的原核表达载体pET30a-NS1s转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达。结果:重组蛋白大小约为43kD,与预期大小相符。Westernblot分析表明,该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。结论:NS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测。 展开更多

关键词 猪细小病毒 NS1蛋白 主要抗原表位区 表达

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猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立 被引量：3

11

作者 冉旭华 闻晓波 +1 位作者 孟凡 周恩民 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期964-967,985,共5页

通过分子生物学软件对GenBank中发表的猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)中国株NS1蛋白的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域,针对此区域设计了1对特异性引物。通过PCR方法扩增出长度为843bp的基因片段,将此片段克隆到原核表... 通过分子生物学软件对GenBank中发表的猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)中国株NS1蛋白的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域,针对此区域设计了1对特异性引物。通过PCR方法扩增出长度为843bp的基因片段,将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,构建了原核表达载体pET30a-NS1,实现了PPVNS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效表达。重组蛋白相对分子质量约为43 000,与预期相符。Western-blot试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。以纯化的该蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为2 mg/L,一抗的最佳稀释倍数为1∶100,阳性标准为:待检血清D450≥0.36,且待检血清D450/阴性血清D450>2,作为阴阳性临界值,初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。用该方法对临床血清样本进行检测,间接ELISA判定为阳性的60份血清,经Western-blot试验只有45份为阳性。随机抽取100份猪血清样品与商品化试剂盒检测结果对比,符合率为96%,表明所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疾病的鉴别诊断奠定了基础。 展开更多

关键词 猪细小病毒 NS1蛋白 主要抗原表位区 表达 间接ELISA

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猪戊型肝炎病毒ORF2主要抗原表位区间接ELISA方法的初步建立 被引量：4

12

作者 闻晓波 王密 +4 位作者 冉旭华 周恩民 李晓娟 侯喜林 朴范泽 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第5期99-102,共4页

应用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端和N端的主要抗原表位区,重组蛋白命名为ORF2-C和ORF2-N,初步建立间接ELISA诊断方法。用重组蛋白ORF2-C和ORF2-N作为诊断抗原,对反应条件进行优化,初步建立ELISA诊断方法。抗原最适包被浓... 应用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端和N端的主要抗原表位区,重组蛋白命名为ORF2-C和ORF2-N,初步建立间接ELISA诊断方法。用重组蛋白ORF2-C和ORF2-N作为诊断抗原,对反应条件进行优化,初步建立ELISA诊断方法。抗原最适包被浓度ORF2-C为8μg/mL、ORF2-N为12μg/mL;血清最适稀释度均为1∶50,ORF2-C作用时间为50min、ORF2-N作用时间为90min;酶标抗体最适稀释度为1∶5000;ORF2-C判定标准:D450nm值≥0.348为阳性,D450nm值<0.348为阴性;ORF2-N判定标准:D450nm值≥0.397为阳性,D450nm值<0.397为阴性。与戊型肝炎病毒诊断试剂盒检测结果相比,阳性符合率分别为93.3%、86.7%。利用重组蛋白建立的ELISA方法特异性、敏感性和重复性均较好,且ORF2-C的检测效率明显高于ORF2-N,该方法的初步建立为进一步完善猪戊型肝炎病毒诊断方法奠定基础。 展开更多

关键词 猪戊型肝炎病毒 ORF2 主要抗原表位区 ELISA

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鹅细小病毒结构蛋白VP3优势抗原表位区的原核表达及其表达产物免疫原性的研究 被引量：4

13

作者 李书光 吴清民 +5 位作者 肖跃强 李峰 张娜 李玲 杨立芳 沈志强 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1038-1042,共5页

为了构建鹅细小病毒亚单位疫苗候选菌株,通过软件优化分析预测鹅细小病毒结构蛋白VP3的抗原表位分布,并设计抗原表位富集区的引物,PCR扩增获得目的片段,双酶切定向连接于pET-30a表达载体,转化BL21表达菌株诱导表达,获得目的蛋白,使用该... 为了构建鹅细小病毒亚单位疫苗候选菌株,通过软件优化分析预测鹅细小病毒结构蛋白VP3的抗原表位分布,并设计抗原表位富集区的引物,PCR扩增获得目的片段,双酶切定向连接于pET-30a表达载体,转化BL21表达菌株诱导表达,获得目的蛋白,使用该蛋白免疫SPF鸡,制备抗血清,使用鹅胚成纤维细胞原代细胞进行中和效价的测定。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a-VP3,通过条件优化蛋白以可溶性形式存在,免疫制备的抗血清中和效价能够达到-2.608。结论:本研究以可溶性形式成功表达了鹅细小病毒结构蛋白VP3优势抗原表位区,且该蛋白作为免疫原具有很好的产生中和抗体的能力。 展开更多

关键词 鹅细小病毒 结构蛋白VP3 优势抗原表位区 中和效价

原文传递

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及抗血清制备 被引量：4

14

作者 周小愿 张星朗 +2 位作者 贾秋红 韩亚慧 高宏伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1407-1411,共5页

目的表达大鲵虹彩病毒(CGSIV)主要衣壳蛋白(MCP)主要抗原表位区蛋白,并制备兔抗血清。方法以大鲵虹彩病毒略阳株(CGSIV-LY)基因组为模板,PCR扩增MCP基因,然后克隆到p ET-21a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫... 目的表达大鲵虹彩病毒(CGSIV)主要衣壳蛋白(MCP)主要抗原表位区蛋白,并制备兔抗血清。方法以大鲵虹彩病毒略阳株(CGSIV-LY)基因组为模板,PCR扩增MCP基因,然后克隆到p ET-21a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法检测重组蛋白的表达和免疫活性,用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。以纯化的重组蛋白为免疫原免疫兔制备抗血清,采用Western blot法和ELISA检测抗血清的免疫特异性并测定效价,利用间接免疫荧光法检测鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞CGSIV。结果表达了相对分子质量(Mr)为29 000的重组蛋白。制备的兔抗MCP血清具有良好的特异性和高滴度,间接免疫荧光法检测结果显示制备的多抗血清能识别EPC细胞中的CGSIV。结论成功表达了大鲵虹彩病毒MCP主要抗原表位区蛋白,并制备高滴度和良好特异性的兔抗血清。 展开更多

关键词 大鲵虹彩病毒 主要衣壳蛋白 主要抗原表位区 原核表达 抗血清

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单纯疱疹病毒1型糖蛋白D主要抗原表位区的表达、纯化及鉴定 被引量：2

15

作者 刘红 刘宾 +1 位作者 和骁 赵晓涛 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2013年第3期350-355,共6页

目的原核表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白D(gD)主要抗原表位区,纯化融合表达蛋白并对其进行鉴定。方法用Lasergene7.0中Protean软件对HSV-1 gD氨基酸序列进行抗原表位预测和分析,筛选出gD主要抗原表位区(gD MED),人工合成该区域cDNA序... 目的原核表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白D(gD)主要抗原表位区,纯化融合表达蛋白并对其进行鉴定。方法用Lasergene7.0中Protean软件对HSV-1 gD氨基酸序列进行抗原表位预测和分析,筛选出gD主要抗原表位区(gD MED),人工合成该区域cDNA序列,构建原核表达载体pET-GST-gD MED;将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过GST.Bind纯化试剂盒对gDMED融合蛋白进行纯化;Western blot对gD MED融合蛋白的免疫活性进行分析。结果 HSV-1 gD在266～394区域富含抗原表位,人工合成了该区域的cDNA序列,并成功构建了原核表达载体pET-GST-gD MED;gD MED融合蛋白主要以可溶形式表达,分子质量约为45 ku,纯度能达95%;Western blot结果显示,gD MED融合蛋白能与感染HSV-1患者的血清发生特异结合。结论成功表达和纯化了具有良好抗原性的HSV-1 gD MED融合蛋白,为HSV免疫诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制提供了依据。 展开更多

关键词 单纯疱疹病毒1型 糖蛋白D 主要抗原表位区 原核表达

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猪细小病毒GZ分离株NS1基因主要抗原表位区原核表达研究 被引量：2

16

作者 刘建 汤德元 +2 位作者 姜德荣 王洪光 李达 《山地农业生物学报》 2013年第5期397-402,共6页

根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株NS1基因序列设计1对特异性引物,对贵州大学动物生物技术实验中心分离的猪细小病毒GZ株接种ST细胞传代培养后,提取病毒DNA,进行PCR扩增PPV NS1基因主要抗原表位区,克隆后测序,随后将该基因... 根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株NS1基因序列设计1对特异性引物,对贵州大学动物生物技术实验中心分离的猪细小病毒GZ株接种ST细胞传代培养后,提取病毒DNA,进行PCR扩增PPV NS1基因主要抗原表位区,克隆后测序,随后将该基因亚克隆至pET-32a(+)载体,构建pET-32a-NS1重组质粒,转化得到重组菌,经IPTG诱导表达,通过亲和柱纯化并复性,制备重组蛋白。Western-blot检测发现,经诱导表达的NS1基因主要抗原表位区蛋白约为64 ku,与预测的大小一致,而且,重组蛋白在纯化复性后能被PPV阳性血清所识别,具有较好的反应原性。 展开更多

关键词 猪细小病毒 NS1基因 主要抗原表位区 原核表达

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非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达 被引量：1

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作者 李秋霞 滕达 +3 位作者 童德文 杨雅麟 田子罡 王建华 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期60-65,共6页

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段(vp73l)。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia co... 人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段(vp73l)。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21(DE3),经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在E.coliBL21(DE3)高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 VP73基因 主要抗原表位区 表达

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猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区的原核表达 被引量：2

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作者 冉旭华 闻晓波 +2 位作者 王密 李冬野 侯喜林 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第1期51-54,共4页

用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端的主要抗原表位区。通过对GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列进行分析,确定了其N端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了1对特异性引物,RT-PCR扩增该区段,并将此片段... 用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端的主要抗原表位区。通过对GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列进行分析,确定了其N端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了1对特异性引物,RT-PCR扩增该区段,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2N,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/LIPTG37℃诱导表达。RT-PCR扩增得到424 bp的片段,重组蛋白大小约为21.8 ku,与预期大小相符。West-ern blotting分析结果表明,该蛋白能与阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有一定的反应原性,为进一步用其建立诊断方法奠定基础。 展开更多

关键词 猪戊型肝炎病毒 ORF2 主要抗原表位区 表达

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猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端主要抗原表位区的原核表达 被引量：1

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作者 冉旭华 闻晓波 +2 位作者 王密 李冬野 侯喜林 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第1期24-27,共4页

利用分子生物学软件分析GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列,确定了其C端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,RT-PCR扩增该区域,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2C,然后... 利用分子生物学软件分析GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列,确定了其C端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,RT-PCR扩增该区域,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2C,然后转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导表达。结果表明,RT-PCR扩增得到301 bp的片段,重组蛋白大小约为18 ku,与预期大小相符。Western blot分析表明,该蛋白与阳性血清发生特异性反应,为进一步利用其建立诊断方法奠定了基础。 展开更多

关键词 猪戊型肝炎病毒 ORF2 主要抗原表位区 表达

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猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及检测PPV抗体的间接ELISA的建立 被引量：1

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作者 范朋举 曹轶梅 +9 位作者 卢曾军 张萌 孙普 付元芳 李平花 白兴文 包慧芳 陈应理 李冬 刘在新 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期902-908,共7页

利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价>0... 利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价>0.18,判为PPV血清抗体阳性;血清抗体效价≤0.18,判为血清抗体阴性。此ELISA的批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%。用此ELISA与商品化PPV IgG检测试剂盒做符合性比较试验;结果,感染猪血清抗体检测符合率为100%,免疫猪血清抗体检测符合率为82%,非免疫健康猪血清抗体检测符合率为78%,样本总体检测符合率为80%。用建立的ELISA检测田间猪血清的PPV抗体,阳性率介于28.8%~37.5%之间,提示上述地区可能存在不同程度的PPV感染情况。本研究为PPV免疫或感染状况的检测提供了一种有用的定性诊断方法。 展开更多

关键词 猪细小病毒 VP2蛋白主要抗原表位区 原核表达 间接ELISA 血清检测

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