【目的】为提高重组人ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)15去整合素结构域蛋白(rhADAM15)的表达水平。【方法】在详尽分析rhADAM15的cDNA和GST(谷胱甘肽-S-转移酶)-ADAM15结构的基础上,选择表达宿主菌并对表达质粒进行改造。...【目的】为提高重组人ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)15去整合素结构域蛋白(rhADAM15)的表达水平。【方法】在详尽分析rhADAM15的cDNA和GST(谷胱甘肽-S-转移酶)-ADAM15结构的基础上,选择表达宿主菌并对表达质粒进行改造。【结果】(1)选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的Escherichia coli.Rosetta(DE3)作为宿主菌,将质粒pGEX-ADAM15转化于其中在最佳诱导表达条件下获得298mg/L融合蛋白GST-ADAM15;(2)采用PCR体外定点突变技术将目标蛋白编码区稀有密码子GGA(Gly425)替换为GGC,使融合蛋白表达水平提高9.4%;(3)通过消除凝血酶识别序列附近的Pro-Glu-Phe残基,提高凝血酶酶切效率,使rhADAM15产量提高了35.7%;(4)在GGA替换为GGC基础上切除"Pro-Glu-Phe"残基,使rhADAM15产量提高到68mg/L,比分别切除"Pro-Glu-Phe"残基、GGA替换为GGC和野生型提高了19.2%、51.1%和61.9%。【结论】这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达。展开更多
目的应用斑马鱼模型研究小金胶囊(麝香、木鳖子、制草乌等)的抗肿瘤作用。方法荧光标记的人乳腺癌细胞(michigan cancer foundation-7,MCF-7)移植入斑马鱼卵黄囊内建立移植瘤模型。小金胶囊以水溶液暴露移植瘤斑马鱼以评价其抗肿瘤作用...目的应用斑马鱼模型研究小金胶囊(麝香、木鳖子、制草乌等)的抗肿瘤作用。方法荧光标记的人乳腺癌细胞(michigan cancer foundation-7,MCF-7)移植入斑马鱼卵黄囊内建立移植瘤模型。小金胶囊以水溶液暴露移植瘤斑马鱼以评价其抗肿瘤作用,用转基因斑马鱼观察其对新生血管形成的抑制作用。吖啶橙染色后,图像分析法评价该药物的体内细胞凋亡诱导作用。结果 26.47、88.24、264.72μg/m L的小金胶囊对斑马鱼MCF-7移植瘤的抑制率分别为31.66%、54.35%、53.77%(P<0.01)。小金胶囊在高质量浓度(264.72μg/m L)下能显著抑制血管形成和诱导细胞凋亡,抑制率和诱导率分别为21.74%和28.92%(P<0.01)。结论小金胶囊能诱导细胞凋亡,抑制MCF-7移植瘤生长和新血管形成,具有潜在的抗肿瘤作用。展开更多
文摘【目的】为提高重组人ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)15去整合素结构域蛋白(rhADAM15)的表达水平。【方法】在详尽分析rhADAM15的cDNA和GST(谷胱甘肽-S-转移酶)-ADAM15结构的基础上,选择表达宿主菌并对表达质粒进行改造。【结果】(1)选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的Escherichia coli.Rosetta(DE3)作为宿主菌,将质粒pGEX-ADAM15转化于其中在最佳诱导表达条件下获得298mg/L融合蛋白GST-ADAM15;(2)采用PCR体外定点突变技术将目标蛋白编码区稀有密码子GGA(Gly425)替换为GGC,使融合蛋白表达水平提高9.4%;(3)通过消除凝血酶识别序列附近的Pro-Glu-Phe残基,提高凝血酶酶切效率,使rhADAM15产量提高了35.7%;(4)在GGA替换为GGC基础上切除"Pro-Glu-Phe"残基,使rhADAM15产量提高到68mg/L,比分别切除"Pro-Glu-Phe"残基、GGA替换为GGC和野生型提高了19.2%、51.1%和61.9%。【结论】这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达。
