截短和融合的绿色荧光蛋白的表达及其荧光特性 被引量：4

1

作者 岳莉莉 齐义鹏 +1 位作者 胡建红 邓小昭 《中国科学（C辑）》 CSCD 1998年第1期15-21,共7页

水母Aequoreavictoria的绿色荧光蛋白 (GFP)是一种能发射强烈荧光的特殊蛋白质 ,其荧光的产生是由于内部第 6 5～ 6 7位的Ser Tyr Gly自身环化和氧化形成生色基团的缘故 .Ser6 5→Thr(简称S6 5T)突变型的荧光强度较野生型GFP高出6倍 ,... 水母Aequoreavictoria的绿色荧光蛋白 (GFP)是一种能发射强烈荧光的特殊蛋白质 ,其荧光的产生是由于内部第 6 5～ 6 7位的Ser Tyr Gly自身环化和氧化形成生色基团的缘故 .Ser6 5→Thr(简称S6 5T)突变型的荧光强度较野生型GFP高出6倍 ,并且其激发波更长 ,肉眼可见发出的强烈荧光 .将 gfpS65T基因从 3′端截短 36bp ,不影响GFPS65T的荧光特性 ,但当截短到 2 2 5bp时 ,几乎失去了荧光特性 .将HBVe抗原基因与突变型 gfpS65TP融合 ,发现其激发光谱又回复到野生型状态 .虽然其荧光强度与 gfpS65T相似 ,但发射波谱变宽且肉眼不能观察 .若将表达这种融合蛋白的菌落在低温下存放数日 ,则又恢复了它肉眼可见的绿色荧光 .以上结果说明GFP的发光机制除与生色基团有关外 ,也与GFP分子的构象完整性和分子内微环境有关 ,野生型GFP与HCVCore抗原的融合也证实了这一点 . 展开更多

关键词 截短基因 荧光特性 绿色荧光蛋白 融合蛋白

原文传递

部分扩增结合双片段连接法克隆系列截短基因突变体 被引量：3

2

作者 梁明星 马梦琪 +2 位作者 程盈盈 王媛 陈华波 《生物技术进展》 2021年第1期111-117,共7页

体外合成DNA伴随的随机突变是制约基因定点突变效率的重要因素。以克隆周期蛋白E(cyclin E)及其截短基因的激酶活性缺失突变体为例,对传统重叠延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)作适当改进,提出一种系列相关基因定点突变的优化方... 体外合成DNA伴随的随机突变是制约基因定点突变效率的重要因素。以克隆周期蛋白E(cyclin E)及其截短基因的激酶活性缺失突变体为例,对传统重叠延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)作适当改进,提出一种系列相关基因定点突变的优化方案。前期研究中已克隆了cyclin E基因及其2个截短基因T1、T2,并通过Eco RⅠ/SalⅠ双酶切插入pEGFP_C2载体。限制性酶切分析发现cyclin E基因序列中含有1个AgeⅠ位点将其分为F1、F2两段,目标突变位点KD位于F2段。对于cyclin E及其截短基因,F2段是完全一致的。因此,通过重叠延伸PCR扩增含突变位点的共有片段F2,从C2-cyclin E、C2-cyclin E_T1和C2-cyclin E_T2这3个原始质粒中切取相应的F1片段,再将F1与酶切的F2一起连接插入载体以重构完整突变体。对比检测发现OE-PCR扩增较短DNA片段更易成功。C2-cyclin E、C2-cyclin E_T1和C2-cyclin E_T2这3组均能筛选出一定数量克隆,经检测和序列鉴定,每组各得到1个序列完全准确的目标突变体。研究表明,采用部分扩增可以缩短DNA合成长度,避免了目标基因反复扩增等不利因素,从而减少随机突变;双片段连接避免了双AgeⅠ位点对常规酶切-连接的限制。两者相结合,可作为其他系列相关基因定点突变的优化方案。 展开更多

关键词 基因定点突变 截短基因 双片段连接 周期蛋白E

下载PDF 职称材料

边缘革蜱aqp 3截短基因的表达、生物信息学分析与多克隆抗体制备 被引量：1

3

作者 伍军 何文文 +7 位作者 普浩 金敏 石文玉 马爱军 罗亭祥 杨德鹏 巴音查汗 呼尔查 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期4589-4599,共11页

【目的】挖掘和检测边缘革蜱(Dermacentor marginatus)水通道蛋白-3(DmAQP3)的免疫原性,为后续研发免疫抗蜱试验提供材料。【方法】利用PCR技术扩增Dmaqp 3基因,构建Dmaqp 3基因氨基酸序列系统发育树。对DmAQP3蛋白进行生物信息学分析,... 【目的】挖掘和检测边缘革蜱(Dermacentor marginatus)水通道蛋白-3(DmAQP3)的免疫原性,为后续研发免疫抗蜱试验提供材料。【方法】利用PCR技术扩增Dmaqp 3基因,构建Dmaqp 3基因氨基酸序列系统发育树。对DmAQP3蛋白进行生物信息学分析,截选抗原性最佳区域构建截短重组质粒pET-32a-jdDmaqp3,表达DmAQP3重组蛋白(rDmAQP3),Western blotting检测重组蛋白的反应原性。将纯化的重组蛋白rDmAQP3免疫昆明小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测多克隆抗体效价。【结果】Dmaqp 3基因PCR扩增片段大小为879 bp,与森林革蜱aqp 3基因(XM_049662329.1)相似性为98.37%,DmAQP3蛋白氨基酸序列与森林革蜱(AQP-9亚型X2)及安氏革蜱(AQP-9样亚型X2)亲缘关系最近。DmAQP3蛋白理论等电点为8.65,是一种稳定蛋白;具有6个跨膜区及2个天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala,NPA)结构;有7个B细胞抗原表位,18个磷酸化位点,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋、β-转角、无规则卷曲及延伸链组成,占比分别为31.27%、3.58%、40.07%和25.08%;三级结构预测显示该蛋白由4个亚基组成。成功构建截短重组质粒pET-32a-jdDmaqp3并获得重组蛋白rDmAQP3。Western blotting结果显示,重组蛋白rDmAQP3与阳性血清反应出现大小为27 ku的目的条带,表明该蛋白具有良好的反应原性。间接ELISA结果显示,制备的重组蛋白rDmAQP3多克隆抗体效价高达1∶409600,表明该蛋白具有良好的免疫原性。【结论】本试验克隆了Dmaqp 3基因,构建了DmAQP3蛋白原核表达载体,诱导表达出重组蛋白rDmAQP3,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,为进一步研究其生物学特性及建立模式动物免疫抗蜱试验提供了条件。 展开更多

关键词 边缘革蜱 截短基因 重组蛋白 Western blotting 多克隆抗体

下载PDF 职称材料

人巨细胞病毒UL32和UL44融合基因的表达及其抗原性分析

4

作者 邓兆享 彭杰雄 +1 位作者 孙兴宝 林连成 《中国热带医学》 CAS 2014年第3期267-270,共4页

目的用聚合酶链式反应(PCR)扩增人巨细胞病毒UL32、UL44截短基因,构建pET-32a-UL32-UL44表达载体,转化宿菌大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,对目的蛋白进行纯化、标记HRP,用于检测IgM抗体。方法根据Gene-bank中HCMV的pp150、pp52蛋白序列,利... 目的用聚合酶链式反应(PCR)扩增人巨细胞病毒UL32、UL44截短基因,构建pET-32a-UL32-UL44表达载体,转化宿菌大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,对目的蛋白进行纯化、标记HRP,用于检测IgM抗体。方法根据Gene-bank中HCMV的pp150、pp52蛋白序列,利用Protean计算机软件分析其亲疏水性和抗原性,选取适合的区段,根据其对应的UL32、UL44基因核苷酸序列设计合成引物,PCR扩增目的基因序列,经测序证明无误之后,克隆pET-32a-UL32-UL44重组质粒,将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行诱导表达,纯化目的蛋白,标记HRP,用ELISA捕获法对目的蛋白-HRP标记物的灵敏性和特异性等指标进行评价。结果成功构建pET-32a-UL32-UL44重组质粒,导入在BL21(DE3)菌株中,经诱导后目的蛋白表达于上清中,经纯化、标记HRP,标记物用于ELISA捕获法能够准确、特异地检测HCMV血清标本,80份血清检测结果显示其灵敏度可达92.5%,特异性达97.5%。结论 HCMV基因工程重组蛋白具有较好的免疫活性,为研制以基因工程重组抗原代替传统全病毒抗原的HCMV检测试剂盒打下了基础。 展开更多

关键词 人巨细胞病毒 截短基因 蛋白纯化 酶联免疫捕获法

原文传递

鲤疱疹病毒2型ORF5截短基因的克隆表达及免疫原性研究 被引量：8

5

作者 廖红 林华 +9 位作者 郝中香 佘容 陈世界 杨苗 陈珍容 薛昌华 赵珊 韩国全 曹三杰 颜其贵 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期1394-1400,共7页

根据G en Bank上已登录的鲤疱疹病毒2型的O RF5基因序列(登录号:AFJ20457.1)设计1对引物,采用PCR扩增技术获得目的基因。序列分析表明,目的基因长357 bp,是一个完整的开放阅读框,编码119个氨基酸,理论分子质量为13 059.70 u,无信号肽,... 根据G en Bank上已登录的鲤疱疹病毒2型的O RF5基因序列(登录号:AFJ20457.1)设计1对引物,采用PCR扩增技术获得目的基因。序列分析表明,目的基因长357 bp,是一个完整的开放阅读框,编码119个氨基酸,理论分子质量为13 059.70 u,无信号肽,无跨膜区,含有4个抗原表位。将扩增片段克隆至原核表达载体p ET-32a中,并将获得的重组质粒转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。对表达蛋白进行复性纯化后免疫小鼠和异育银鲫,SD S-PAGE和W estern-blot检测分析表明,重组蛋白的分子质量约为33 ku,与预期相符,表达形式为包涵体,该蛋白能够与抗H is标签的抗体发生特异性反应,也能识别病毒粒子上的ORF5蛋白。对免疫的异育银鲫进行攻毒,结果显示注射生理盐水组的银鲫保护率为0,注射15、25、50 g重组蛋白组的保护率分别为20%、30%、35%,表明免疫重组蛋白组的保护率高于对照组。本研究证实了表达的融合蛋白具有一定的免疫原性,丰富了鲤疱疹病毒2型ORF5基因及基因组的研究,为研发制备新型鲤疱疹病毒2型的疫苗和诊断试剂盒奠定了基础。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型 ORF5截短基因 序列分析 克隆表达 攻毒保护试验

原文传递

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2截短基因的克隆及原核表达 被引量：8

6

作者 林彦星 孙彦伟 +2 位作者 刘镇明 戚一达 耿忠海 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期464-468,共5页

参照GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type 2，PCV2）的ORF2基因序列，设计合成1对引物，对PCV-2ZS株ORF2基因上含主要抗原位点的片段（ORF2-ME）进行PCR扩增，并克隆到pMD18-T Simple Vector中，进行序列测定。将重组质粒... 参照GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type 2，PCV2）的ORF2基因序列，设计合成1对引物，对PCV-2ZS株ORF2基因上含主要抗原位点的片段（ORF2-ME）进行PCR扩增，并克隆到pMD18-T Simple Vector中，进行序列测定。将重组质粒pMD—ORF2-ME的EcoR Ⅴ和Xhol Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pET-32a（＋），构建原核表达载体pET—ORF—ME。测序分析表明，克隆的ORF2-ME与GenBank上公布的PCV2毒株核苷酸序列同源性为99％～100％，推导的氨基酸序列同源性介于91％～100％之间。原核表达载体导入BL21（DE3）后用IPTG进行诱导表达，收集菌液进行SDS—PAGE和Western Blotting分析，结果表明ORF2-ME在BL21（DE3）中成功表达，所表达融合蛋白的相对分子质量约为40000，并能被PCV2阳性血清所识别，这就为PCV2感染诊断和抗体检测提供了依据。 展开更多

关键词 PCV2 ORF2截短基因 克隆 表达

下载PDF 职称材料

鸭圆环病毒基因组序列分析及其C1截短基因的原核表达 被引量：4

7

作者 施少华 陈珍 +5 位作者 杨维星 傅光华 程龙飞 陈红梅 彭春香 黄瑜 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1269-1273,共5页

本试验参照GenBank登录的鸭圆环病毒（DuCV）基因组序列，设计2对DuCV特异性引物，运用PCR方法从病死番鸭法氏囊中分段扩增出DuCV LJ07株基因组，将扩增片段分别克隆获得重组质粒，测序后得到全长为1995 nt的DuCV LJ07株全基因组序列，... 本试验参照GenBank登录的鸭圆环病毒（DuCV）基因组序列，设计2对DuCV特异性引物，运用PCR方法从病死番鸭法氏囊中分段扩增出DuCV LJ07株基因组，将扩增片段分别克隆获得重组质粒，测序后得到全长为1995 nt的DuCV LJ07株全基因组序列，与GenBank登录的DuCV基因组序列的同源性达83．6％～96．5％。经基因结构分析发现，DuCV LJ07株的基因组有6个开放阅读框（ORF），其中V1、C1是2个最主要的ORF，分别编码Rep蛋白和Cap蛋白；在V1和C1的5’起始端之间有与启动滚环复制有关的一茎环结构和2个正向重复序列。本试验同时还构建了去除核定位信号的C1截短基因的原核表达载体，诱导表达后经sDS-PAGE和Western-blotting分析表明C1截短基因已成功地在大肠杆菌中表达出Cap截短蛋白，为建立DuCV抗体血清学检测方法和开展DuCV感染的血清学调查奠定了基础。 展开更多

关键词 鸭圆环病毒 基因组 序列分析 C1截短基因 原核表达

原文传递

BVDV-E2截短基因重组卡介苗对牛的免疫效果评价 被引量：4

8

作者 时坤 李男 +7 位作者 刁乃超 李健明 冯海峰 姚泽慧 田甜 宗颖 曾范利 杜锐 《动物医学进展》 北大核心 2020年第1期34-38,共5页

为评价牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对牛的免疫效果,将BVDV抗原抗体阴性牛随机分为rBCG-pMV361-E2-1(1 aa-297aa)、rBCG-pMV361-E2-2(1 aa-345 aa)、rBCG-pMV361-E2-3(1 aa-374 aa)、rBCG-pMV361-E2-4(45 aa-297 aa)、rB... 为评价牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对牛的免疫效果,将BVDV抗原抗体阴性牛随机分为rBCG-pMV361-E2-1(1 aa-297aa)、rBCG-pMV361-E2-2(1 aa-345 aa)、rBCG-pMV361-E2-3(1 aa-374 aa)、rBCG-pMV361-E2-4(45 aa-297 aa)、rBCG-pMV361-E2-5(45 aa-345 aa)、rBCG-pMV361-E2-6(45 aa-374 aa)、BVDV对照组、BCG对照组和PBS对照组,各组牛免疫相应疫苗后通过特异性抗体检测、淋巴细胞增殖试验、淋巴细胞亚群检测和细胞因子检测分析疫苗的免疫效果。结果显示,BVDV E2截短基因重组卡介苗均可诱导BVDV特异性抗体的产生,rBCG-pMV361-E2-1组抗体水平高于其他重组卡介苗试验组和BVDV对照组。淋巴细胞增殖试验结果显示,rBCG-pMV361-E2-2组SI为2.038±0.21,显著高于其他重组卡介苗试验组(P<0.01)。牛外周血CD4^+、CD8^+T淋巴细胞亚群检测结果显示,rBCG-pMV361-E2-5组牛外周血中CD4^+和CD8^+ T淋巴细胞亚群含量与PBS组比较,差异极显著(P<0.01)。IFN-γ检测结果显示,rBCG-pMV361-E2-1的IFN-γ水平显著高于其他试验组和对照组(P<0.01)。研究表明,rBCG-pMV361-E2-1可诱导接种牛产生较好的体液免疫应答,rBCG-pMV361-E2-1、rBCG-pMV361-E2-2和rBCG-pMV361-E2-5在诱导细胞免疫应答上效果较好。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2截短基因 重组卡介苗 免疫评价

下载PDF 职称材料

猪圆环病毒2型ORF2截短基因片段真核表达载体的构建及其DNA疫苗的免疫效果 被引量：2

9

作者 张宁 李茂宁 +7 位作者 侯韶毅 兰家暖 谢丽华 黄伟坚 冯励 韦英益 刘芳 李军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期327-332,共6页

为研究猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2截短基因片段核酸疫苗的免疫效果,以PCV-2 GXWZ-1株为模板,用PCR方法扩增出ORF2基因及其截短基因共8个片段[A(ORF2)、B(51～100 aa)、C(101～150 aa)、D(181～235 aa)、E(151～200 aa)、F(51～150 aa)、G... 为研究猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2截短基因片段核酸疫苗的免疫效果,以PCV-2 GXWZ-1株为模板,用PCR方法扩增出ORF2基因及其截短基因共8个片段[A(ORF2)、B(51～100 aa)、C(101～150 aa)、D(181～235 aa)、E(151～200 aa)、F(51～150 aa)、G(101～235 aa)、H(51～235 aa)],将其插入pcD-NA3.0载体中,成功构建了pcDNA-A、pcDNA-B、pcDNA-C、pcDNA-D、pcDNA-E、pcDNA-F、pcDNA-G、pcDNA-H。将纯化后的真核表达质粒转染PK-15细胞后,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的瞬时表达情况。分别用单独免疫和组合免疫的方法免疫小鼠,每只0.15 mg,用ELISA试剂盒检测小鼠血清中的抗体效价,并分析这两种方法的免疫效果。结果显示,6个片段较短的重组质粒(pcDNA-B、pcDNA-C、pcDNA-D、pcDNA-E、pcDNA-F、pcDNA-G)转染的细胞中均有明显且较亮的荧光出现,而2个片段较长的重组质粒(pcDNA-A、pcDNA-H)及空载体pcDNA3.0转染的细胞中没有荧光出现。在单独免疫组中,这8个片段的真核表达质粒都能刺激机体产生特异性抗体,其中片段较短的pcDNA-C、pcDNA-D、pcDNA-E的免疫效果比较理想;在组合免疫中,除pcDNA-C-F外,各个真核表达质粒都能产生较高水平且稳定的抗体,其中pcDNA-D-H、pcDNA-B-F的免疫效果最好。表明组合免疫要比单独免疫的效果好。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 ORF2截短基因 真核表达 重组质粒 免疫效果

下载PDF 职称材料

HSV-1截短gB基因DNA疫苗的构建及初步鉴定 被引量：1

10

作者 史霖 范桂香 +1 位作者 袁育康 王军阳 《西安医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期425-428,450,共5页

目的　为有效预防单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV - 1 )感染 ,给多价DNA疫苗的构建奠定基础 ,构建表达截短HSV - 1 gB糖蛋白的DNA疫苗。方法　用PCR技术从HSV - 1基因组中扩增出编码HSV 1gB糖蛋白 1 - 5 1 7氨基酸序列的一段基因序列 ,通过 pGEM... 目的　为有效预防单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV - 1 )感染 ,给多价DNA疫苗的构建奠定基础 ,构建表达截短HSV - 1 gB糖蛋白的DNA疫苗。方法　用PCR技术从HSV - 1基因组中扩增出编码HSV 1gB糖蛋白 1 - 5 1 7氨基酸序列的一段基因序列 ,通过 pGEM -T中介载体 ,将其插入到真核表达质粒pcDNA 3 1 (+)的CMV启动子下游。结果　构建的重组真核表达质粒可在动物体内正确表达目的基因 ,对HSV - 1病毒攻击具有免疫保护作用。结论　本研究对截短HSV - 1 gB基因DNA疫苗进行了初步的探索性研究 ,也为多价HSV 1DNA疫苗的构建奠定了基础。 展开更多

关键词 单纯疱疹病毒I型 糖蛋白B截短基因 DNA疫苗 分子克隆

下载PDF 职称材料

人类疱疹病毒8型ORF50基因截短片段和vIL-6全长基因的克隆、表达及表达产物的纯化 被引量：1

11

作者 徐静 朱晓蕾 +1 位作者 秦娣 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期303-307,共5页

目的:克隆人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)ORF50截短基因和编码病毒IL-6(vIL-6)全长基因,将其置于大肠杆菌中作融合表达,并纯化融合表达的vIL-6。方法:分别以本实验室先前构建的重组质粒pcDNA3.1+ORF50和pcD-NA3.1+vIL-6为... 目的:克隆人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)ORF50截短基因和编码病毒IL-6(vIL-6)全长基因,将其置于大肠杆菌中作融合表达,并纯化融合表达的vIL-6。方法:分别以本实验室先前构建的重组质粒pcDNA3.1+ORF50和pcD-NA3.1+vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含HHV-8ORF50截短基因的重组原核表达质粒pORF50-C1,pORF50-C2,pORF50-C3和含vIL-6全长基因的重组原核表达质粒pvIL-6。重组质粒经酶切鉴定和核酸序列测定正确后转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。用glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化vIL-6表达产物。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot检测GST融合蛋白的表达和纯化情况。结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的序列与基因数据库中已登记的HHV-8相应序列呈现100%同源;IPTG诱导后的菌体,经SDS-PAGE,显示有相应大小的融合表达蛋白产生。Western blot亦在预期的位置检测到特异性条带。结论:在E.coli中获得了正确表达的HHV-8ORF50基因3个截短片段和vIL-6全长基因,并成功纯化了vIL-6融合蛋白。 展开更多

关键词 人类疱疹病毒8型 ORF50截短基因 vIL-6全长基因 原核表达 亲和层析

下载PDF 职称材料

牛病毒性腹泻病毒E2截短基因重组卡介苗安全性和最佳免疫剂量的研究 被引量：1

12

作者 杨宇航 李晶 +6 位作者 张云 郝俊伟 刘东旭 时坤 李健明 曾范利 杜锐 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第7期34-37,共4页

将6组BVDV-E2截短基因重组卡介苗用生理盐水稀释,分别进行革兰染色和伊红美蓝平板检测,6组重组卡介苗均无杂菌污染。再对6周龄～8周龄雄性豚鼠进行免疫接种,每只腹腔注射1mL（5×106 cfu/只）,免疫接种豚鼠无任何症状,精神、食欲、... 将6组BVDV-E2截短基因重组卡介苗用生理盐水稀释,分别进行革兰染色和伊红美蓝平板检测,6组重组卡介苗均无杂菌污染。再对6周龄～8周龄雄性豚鼠进行免疫接种,每只腹腔注射1mL（5×106 cfu/只）,免疫接种豚鼠无任何症状,精神、食欲、排便及发育等均不受影响,且无死亡,说明重组病毒对试验豚鼠是安全的。使用BVDV抗体检测试剂盒对60头健康牛的母源抗体含量进行检测,不含母源抗体占85.00%。取重组卡介苗中的一组,用生理盐水稀释,使重组卡介苗达到105、106、107、108、109 cfu/mL共5组,每组不含母源抗体的牛3头,免疫接种前对每头牛进行尾颈静脉采血,析出血清,用BVDV抗体检测试剂盒测牛血清中抗体水平。采完血后对牛进行皮下免疫接种,4周后,采取血液,检测牛血清中抗体水平。通过免疫接种后的检测结果可知,重组疫苗对牛最佳免疫剂量为108 cfu/mL,为进一步进行重组疫苗回归本动物的免疫效果研究提供了可靠依据。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2截短基因 重组卡介苗 最佳免疫剂量 安全性

下载PDF 职称材料

应用流式细胞术检测BVDV-E_2截短基因重组卡介苗对小鼠的免疫效果 被引量：1

13

作者 杨宇航 宋纪伟 +7 位作者 时坤 曾范利 李健明 刘红娜 王文玉 郝俊伟 刘东旭 杜锐 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期551-559,共9页

为评价牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对小鼠的免疫效果,用BVDV-E2截短基因重组卡介苗pMV361-E11、pMV361-E12、pMV361-E13、pMV361-E21、pMV361-E22、pMV361-E23及卡介苗、BVDV灭活苗和生理盐水对试验小鼠进行腹... 为评价牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对小鼠的免疫效果,用BVDV-E2截短基因重组卡介苗pMV361-E11、pMV361-E12、pMV361-E13、pMV361-E21、pMV361-E22、pMV361-E23及卡介苗、BVDV灭活苗和生理盐水对试验小鼠进行腹腔免疫,在三免后14d取其脾脏对T、B淋巴细胞、树突状细胞及Th1细胞等细胞因子进行流式细胞术检测,评价各重组卡介苗的免疫效果。结果显示,pMV361-E23重组卡介苗组中各细胞因子的表达量尽管有个别因子在同组中不是最高,但均高于同组生理盐水的表达量(除INF-γ检测中略低外);pMV361-E12组中IL-12的含量高达9.7。表明pMV361-E23和pMV361-E122组截短重组卡介苗免疫效果较好,为预防牛病毒性腹泻病以及新型疫苗的研制奠定基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒 E2截短基因 重组卡介苗 流式细胞术 免疫效果

原文传递

猪圆环病毒2型核酸疫苗的小鼠免疫保护试验 被引量：1

14

作者 张宁 侯韶毅 +8 位作者 韦英益 李茂宁 肖爱欢 谢丽华 刘芳 高永锐 卢桂娟 陆有飞 黄伟坚 《畜牧与兽医》 北大核心 2010年第1期11-16,共6页

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)核酸疫苗在小鼠攻毒试验中的免疫保护效果,以PCV-2 GXWZ-1株为模板,扩增出ORF2基因及其截短基因8个片段(A(ORF2)、B(51-100aa)、C(101-150aa)、D(181-235aa)、E(151-200aa)、F(51-150aa)、G(101-235aa)、H(5... 为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)核酸疫苗在小鼠攻毒试验中的免疫保护效果,以PCV-2 GXWZ-1株为模板,扩增出ORF2基因及其截短基因8个片段(A(ORF2)、B(51-100aa)、C(101-150aa)、D(181-235aa)、E(151-200aa)、F(51-150aa)、G(101-235aa)、H(51-235aa)),将其插入到pcDNA3.0载体中,构建出真核表达质粒,并将其转染至PK-15细胞,用间接免疫荧光试验检测其瞬时表达情况。将试验小鼠随机分成9组,其中免疫组7组,阴阳性对照各1组,将纯化的真核表达质粒对小鼠进行组合免疫;二免后,用经处理过的PCV-2 GXWZ-2株阳性病料悬液腹腔注射免疫组和非免疫对照组小鼠,阴性对照组用生理盐水腹腔注射;其后进行体重记录、病理切片制作及PCR检测。结果表明:共有6个真核表达质粒成功在PK-15细胞中表达。在攻毒后的3周内,阳性对照组小鼠PCR诊断均为阳性;免疫组中,部分组小鼠在攻毒后第1周或在第2周为阳性,到第3周时各免疫组小鼠全部为阴性;阴性对照组始终为阴性。免疫组在病理保护学方面明显优于非免疫对照组,非免疫对照组的体重增长速率略低于免疫组和阴性对照组。由此可见猪圆环病毒2型核酸疫苗在小鼠攻毒试验中有明显的保护作用。 展开更多

关键词 ORF2截短基因 重组质粒 间接免疫荧光试验 组合免疫 免疫保护效果

下载PDF 职称材料

猪CD205分子CysR-FNⅡ截短基因的克隆表达及应用 被引量：1

15

作者 高文昊 杜露平 +5 位作者 侯立婷 于晓明 陈瑾 冯秀丽 郑其升 程海卫 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2022年第5期1272-1277,共6页

为克隆表达编码猪CD205分子的CysR-FNⅡ截短基因片段,并验证其生物学活性,提取了猪淋巴组织总RNA,并合成cDNA,利用PCR方法扩增编码猪CD205分子的CysR-FNⅡ截短基因,构建pET-32a-CysR-FNⅡ原核重组表达质粒,转化至大肠杆菌BL21,分别进行... 为克隆表达编码猪CD205分子的CysR-FNⅡ截短基因片段,并验证其生物学活性,提取了猪淋巴组织总RNA,并合成cDNA,利用PCR方法扩增编码猪CD205分子的CysR-FNⅡ截短基因,构建pET-32a-CysR-FNⅡ原核重组表达质粒,转化至大肠杆菌BL21,分别进行诱导表达与蛋白质纯化,利用制备的目的蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体,经间接免疫荧光试验和流式细胞分析鉴定。SDS-PAGE与Western Blot鉴定结果显示,目的蛋白以可溶性形式表达,大小约4.0×10^(4),与理论值一致。一次免疫后14 d抗体效价达1∶3200。间接免疫荧光试验和流式分析结果显示,获得的多克隆抗体可与猪骨髓来源树突状细胞发生特异性结合。说明该重组表达蛋白质具有相应的生物学活性,可用于猪CD205抗原靶向研究。 展开更多

关键词 猪 CD205 CysR-FNⅡ截短基因 原核表达 生物学活性

下载PDF 职称材料

水貂阿留申病病毒VP2截短基因的原核表达

16

作者 李晶 时坤 +2 位作者 曾范利 宋继伟 杜锐 《动物医学进展》 北大核心 2015年第4期15-18,共4页

为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进... 为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进行诱导表达,确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和Western blot分析,表明终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h目的蛋白的表达量最高,分子质量约为53ku。SDS-PAGE分析表明,葡萄糖和乙醇抑制了目的蛋白的表达,而蔗糖、甘油和二甲基亚砜提高了目的蛋白的表达量,获得的目的蛋白具有良好的反应原性。 展开更多

关键词 水貂阿留申病病毒 VP2截短基因 原核表达

下载PDF 职称材料

单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B基因疫苗的构建及其诱导小鼠细胞免疫应答

17

作者 李光源 贺冰 +3 位作者 冯非 孟祥俊 宋忆淑 王晓祺 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期454-459,共6页

目的：构建、制备单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B DNA疫苗，检测其诱导机体产生的细胞免疫应答效果。方法：利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1 gB14-507氨基酸序列的一段基因。定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中，构建... 目的：构建、制备单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B DNA疫苗，检测其诱导机体产生的细胞免疫应答效果。方法：利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1 gB14-507氨基酸序列的一段基因。定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中，构建出重组真核表达质粒pcDNA3-gBt，并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。于BALB/c鼠注射免疫3次，抗体分析CD4＋、CD8＋T细胞亚群的变化，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）/碘化丙碇（PI）双标记的流式细胞计数法检测CTL活性。结果：PCR及测序鉴定结果显示，插入的克隆基因与GenBank中HSV-1F株gB基因序列一致，证实了HSV-1 gBt核酸疫苗的构建；pcDNA3-gBt免疫组BALB/c鼠的CD4＋T细胞数较空质粒（pcDNA3）对照组和生理盐水对照组增加，CTL活性也较对照组明显增强，但是pcDNA3-gBt免疫组BALB/c鼠的CD8＋T细胞、CD4＋/CD8＋T细胞比值与对照组比较差异均无显著性（P〉0.05）。结论：HSV-1 gBt核酸疫苗诱导较强的细胞免疫应答。 展开更多

关键词 疱疹病毒1型 人 疫苗 DNA 糖蛋白B截短基因 流式细胞术 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯

下载PDF 职称材料

刚地弓形虫SRS29C截短型基因的克隆及原核表达质粒的构建 被引量：1

18

作者 袁娣 邵怡 +3 位作者 张同瑶 姜阜杉 李秀荣 宋淇淇 《天津农学院学报》 CAS 2021年第3期50-55,共6页

为构建刚地弓形虫SRS29C基因原核表达质粒,利用SignalP-5.0软件预测信号肽序列,去除SRS29C前端信号肽序列,设计引物并扩增SRS29C截短型基因序列,克隆并构建原核表达质粒。结果显示:SRS29C基因前51位氨基酸为信号肽区域,故将此段信号肽... 为构建刚地弓形虫SRS29C基因原核表达质粒,利用SignalP-5.0软件预测信号肽序列,去除SRS29C前端信号肽序列,设计引物并扩增SRS29C截短型基因序列,克隆并构建原核表达质粒。结果显示:SRS29C基因前51位氨基酸为信号肽区域,故将此段信号肽序列切除,获得长度为966bp的SRS29C截短型基因片段(SRS29Ccut),成功构建原核表达质粒p ET-28a-SRS29Ccut和p ET-32a-SRS29Ccut。此研究为今后对刚地弓形虫SRS29C蛋白的生物学功能及免疫特性进行更深入研究打下基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 SRS29C 截短型基因 原核表达质粒

下载PDF 职称材料

HCMV截短UL83基因真核表达重组体的构建、转染及其免疫效力研究 被引量：2

19

作者 高荣保 李艳秋 王明丽 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期451-455,T0001,共6页

为了构建人巨细胞病毒（HCMV）截短UL83基因真核表达重组体，实现其在Hep-2细胞中的稳定表达，研究该截短UL83基因真核表达重组体免疫效力，采用基因重组的方法，将HCMVAD169株截短UL83基因定向克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告... 为了构建人巨细胞病毒（HCMV）截短UL83基因真核表达重组体，实现其在Hep-2细胞中的稳定表达，研究该截短UL83基因真核表达重组体免疫效力，采用基因重组的方法，将HCMVAD169株截短UL83基因定向克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上，构建真核重组表达质粒pEGFP-C1-UL83；脂质体转染至Hep-2细胞中，G418筛选获得稳定表达pp65细胞表达系。经基因测序屁示，重组体中截短UL83基因完全正确。RT-PCR和Westem blot检测证实其可在Hep-2细胞中稳定表达。用该重组体和其表达产物在HCMV先天性感染小鼠模型上进行免疫保护试验显示，母鼠血清可检测到特异性抗HCMVpp65抗体，效价为：1：2．51～1：50．79；子鼠脑组织内未分离出病毒，亦未检测出病毒pp65蛋白抗原表达。初步结果表明，pEGFP-C1-UL83具有较好的免疫原性，可作为DNA疫苗刺激机体产生有效抗体。并具有阻止病毒垂直传播的保护性作用。 展开更多

关键词 HCMV截短uL83基因 绿色荧光蛋白 转染 HEP-2细胞 DNA疫苗

下载PDF 职称材料

弓形虫截短SAG2基因的克隆表达与免疫活性分析 被引量：1

20

作者 赵东岳 陈金锋 韦剑辉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2258-2263,共6页

构建截短的弓形虫表面抗原2(SAG2)原核表达系统,并探讨其抗原活性。PCR扩增去掉信号肽和C-末端的SAG2基因片段,插入原核表达载体pGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5α,并用IPTG诱导。SDS-PAGE和Western blot鉴定重组SAG2t的表达及其免疫反应... 构建截短的弓形虫表面抗原2(SAG2)原核表达系统,并探讨其抗原活性。PCR扩增去掉信号肽和C-末端的SAG2基因片段,插入原核表达载体pGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5α,并用IPTG诱导。SDS-PAGE和Western blot鉴定重组SAG2t的表达及其免疫反应原性。每升菌液约纯化出4mg rSAG2t蛋白;Western blot显示,ME49株感染的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可强烈识别表达的截短SAG2蛋白。原核表达体系实现了截短的SAG2蛋白的可溶性表达,并具有良好的完全抗原活性。 展开更多

关键词 弓形虫RH株/ME49株 免疫印记 截短SAG2基因

下载PDF 职称材料