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应用DGGE技术研究扇贝养殖海域微型真核浮游生物多样性 被引量：5
1
作者 吴寅嵩 李赟 +1 位作者 王娜 王崇明 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期140-147,共8页
为了研究扇贝养殖海区微型真核浮游生物群落多样性,明确养殖扇贝发病时期高丰度微型真核浮游生物种类,探讨微型真核浮游生物与栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viralnecrosis virus,AVNV)水平传播的可能关系。于2009年和2010年从青岛... 为了研究扇贝养殖海区微型真核浮游生物群落多样性,明确养殖扇贝发病时期高丰度微型真核浮游生物种类,探讨微型真核浮游生物与栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viralnecrosis virus,AVNV)水平传播的可能关系。于2009年和2010年从青岛流清河湾扇贝养殖海区采集了9个月份的海水样品,经25和3μm的滤膜过滤收集海水中3～25μm的浮游生物,扩增18S rDNA可变区序列,并利用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)技术对扩增序列进行分离以分析微型真核浮游生物多样性。结果表明,该养殖海区微型真核生物包括甲藻、纤毛虫、眼虫、定鞭藻、硅藻、盘蜷虫、隐藻、领鞭毛虫、变形虫和Cercozoan,其中甲藻类和纤毛类生物的最高相对丰度分别达41.0%和38.2%,是海区的优势种类。各月份DGGE谱带聚类分析结果表明,2009年6、7、8、9月份浮游生物群落组成较为相似。中肋骨条藻在扇贝发病前后均有分布。结合相关扇贝AVNV已有的研究结果,研究认为中肋骨条藻是AVNV水平传播的参与者之一,但海区中广泛分布的甲藻和纤毛虫与AVNV传播的关系还有必要进一步研究。 展开更多
关键词 浮游生物 栉孔扇贝 急性病毒性坏死病毒 变性梯度凝胶电泳
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急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析 被引量：5
2
作者 贾志磊 王崇明 +3 位作者 任伟成 梁彦韬 曲朋 李赟 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1320-1326,共7页
根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,... 根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dUTPase。表达产物经Co2+柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dUTPase能特异性催化dUTP,EDTA可以抑制dUTPase的活性,而Mg2+可以增强其活性。 展开更多
关键词 栉孔扇贝 dUTP焦磷酸酶 急性病毒性坏死病毒 原核表达 酶学活性
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急性病毒性坏死病毒IAP-86基因的克隆、表达及抗凋亡研究 被引量：4
3
作者 张帅 王崇明 +3 位作者 宋晓玲 白昌明 黄倢 李晨 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期274-281,共8页
在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒... 在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒pET32a-IAP86,将重组质粒转化到E.coil BL21(DE3)中,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测显示表达蛋白分子量约为40 ku,经Western-blotting和质谱分析证明,该蛋白即为IAP-86融合蛋白,Co2+柱纯化后得到了纯化的IAP-86融合蛋白。将重组的IAP-86蛋白用FITC标记,荧光显微镜下观察,发现重组的IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合。细胞凋亡检测实验发现,重组的IAP-86蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡,凋亡抑制率为7%。本实验应用原核表达成功得到了IAP-86蛋白,并证明IAP-86对栉孔扇贝细胞的凋亡有一定抑制作用,这为进一步研究AVNV的侵染机制提供依据。 展开更多
关键词 栉孔扇贝 急性病毒性坏死病毒 杆状病毒凋亡抑制蛋白 原核表达 抗凋亡
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栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒cDNA文库的构建及部分序列分析 被引量：3
4
作者 王崇明 艾海新 +2 位作者 刘英杰 王秀华 李赟 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期421-425,共5页
急性病毒性坏死症病毒(Acute Virus Necrobiotic Virus,AVNV)已被证实是一种对养殖栉孔扇贝(Chlamys farreri)危害极大的致病病原。本研究应用基因克隆技术对AVNV基因组进行cDNA合成、克隆,并对部分克隆进行序列分析。采用差速和蔗糖密... 急性病毒性坏死症病毒(Acute Virus Necrobiotic Virus,AVNV)已被证实是一种对养殖栉孔扇贝(Chlamys farreri)危害极大的致病病原。本研究应用基因克隆技术对AVNV基因组进行cDNA合成、克隆,并对部分克隆进行序列分析。采用差速和蔗糖密度梯度离心法,分离纯化AVNV。用Trizol试剂抽提病毒RNA,采用随机引物和Oligo(dT)双引物法,SuperScriptⅡ反转录酶合成cDNA,并克隆于pUC118质粒上,利用蓝白斑筛选阳性克隆子,PCR法快速鉴定重组质粒。经筛选得到2个阳性克隆23#、52#,插入片段大小约为1 200 bp和800 bp。测序结果与GenBank的比对分析显示,尚未有类似的序列报道,提示该病毒可能为一种新发现的病毒。 展开更多
关键词 栉孔扇贝 急性病毒性坏死病毒 CDNA文库 克隆 序列分析
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栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒巢式PCR检测方法的建立 被引量：3
5
作者 李晨 王崇明 +1 位作者 曲朋 黄倢 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期281-287,共7页
为更好地实现对养殖海区栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)的快速诊断和分子流行病学的调查,以及AVNV的疫情监测,选择AVNV全基因组序列中的保守区段,应用Accelrys gene 2.5软件设计一对巢式引物,用于AVNV的... 为更好地实现对养殖海区栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)的快速诊断和分子流行病学的调查,以及AVNV的疫情监测,选择AVNV全基因组序列中的保守区段,应用Accelrys gene 2.5软件设计一对巢式引物,用于AVNV的检测。结果显示,引物的扩增片段分别为979和548 bp。实验优化了PCR体系中Mg2+和dNTPs浓度及扩增程序中的退火温度,并建立了完善的AVNV巢式PCR检测技术。研究表明,该PCR检测技术具有较高的敏感性,可稳定检测出5 pg扇贝样品组织总核酸中5×10 copies的病毒粒子。 展开更多
关键词 栉孔扇贝 急性病毒性坏死病毒 巢式PCR
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扇贝养殖海区中小型浮游生物携带AVNV的荧光定量检测 被引量：1
6
作者 蔡玉勇 任伟成 +3 位作者 曲朋 贾志磊 王崇明 李赟 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期735-741,共7页
为了解中小型浮游生物与扇贝急性病毒性坏死症（AVND）的流行传播关系,于2009年对青岛流清河与荣成桑沟湾2个不同扇贝养殖海区的浮游生物进行了采样调查,利用荧光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR）技术对所采集样品携带... 为了解中小型浮游生物与扇贝急性病毒性坏死症（AVND）的流行传播关系,于2009年对青岛流清河与荣成桑沟湾2个不同扇贝养殖海区的浮游生物进行了采样调查,利用荧光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR）技术对所采集样品携带急性病毒性坏死病毒（AVNV）的情况进行了定量检测。结果表明,2个扇贝养殖海区的浮游生物样品均检测到AVNV,而且不同粒径的浮游生物携带AVNV载量有差异（P〈0.05）：小于200目粒径的浮游生物携带AVNV载量最大,达到9.45×106 copy/mg（DNA）;60~200目粒径的浮游生物次之,大于60目粒径的浮游生物携带量最少,仅为5.81×104 copy/mg（DNA）。在上述2个扇贝养殖海区,均在8月份检测到浮游生物携带AVNV。该结果与栉孔扇贝夏季大规模死亡在时间上是吻合的。结论认为,中小型浮游生物可以携带AVNV,并有可能在扇贝急性病毒性坏死症的流行和传播中起到传播媒介的作用。 展开更多
关键词 急性病毒性坏死病毒 栉孔扇贝 浮游生物 病毒携带 荧光定量技术
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两个海区栉孔扇贝感染AVNV的比较分析 被引量：1
7
作者 杨彩霞 李赟 +2 位作者 王崇明 曲朋 黄倢 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1579-1584,共6页
急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)是一种能导致栉孔扇贝大规模死亡的DNA病毒,研究通过检测不同养殖模式和不同苗种来源的栉孔扇贝样本携带AVNV的情况,以寻找合理的养殖模式和苗种,降低疾病的发生。以扇贝单一养殖... 急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)是一种能导致栉孔扇贝大规模死亡的DNA病毒,研究通过检测不同养殖模式和不同苗种来源的栉孔扇贝样本携带AVNV的情况,以寻找合理的养殖模式和苗种,降低疾病的发生。以扇贝单一养殖的青岛流清河海区和贝藻间养的荣成桑沟湾海区为采样点,每月(2010年3月—2011年4月)定期采集2个海区野生苗养殖和人工苗养殖的栉孔扇贝样品各10只,共得到扇贝样本480只。取扇贝外套膜组织,提取DNA,采用巢式PCR检测扇贝感染AVNV的情况,并对2个海区2类栉孔扇贝AVNV感染率进行比较。结果显示,在2个海区的2类栉孔扇贝体内均检测到AVNV,流清河海区野生苗和人工苗养殖栉孔扇贝AVNV感染率分别为21.1%和18.9%,桑沟湾海区2类扇贝AVNV感染率分别为11.1%和5.6%;2个海区AVNV感染扇贝均集中在7、8月份,其中,流清河海区最高可达80%,桑沟湾海区最高仅40%。研究表明,贝藻间养和选用人工苗能有效减少AVNV对养殖扇贝的感染,是控制养殖扇贝发病死亡的有效措施。 展开更多
关键词 栉孔扇贝 急性病毒性坏死病毒 巢式PCR 养殖模式
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急性病毒性坏死病毒魁蚶株IAP-86基因全长cDNA克隆和生物信息学分析 被引量：1
8
作者 张帅 王崇明 +4 位作者 岳志芹 宋晓玲 白昌明 尹伟力 黄倢 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2015年第1期85-90,共6页
为深入探讨急性病毒性坏死病毒(Acute Viral Necrosis Virus,AVNV)魁蚶株的致病机理以及IAP-86蛋白的功能,从感染AVNV的濒死魁蚶外套膜中提取总RNA,反转录获得c DNA。根据NCBI公布的AVNV全基因组序列中ORF86序列设计两对反向套式引物,通... 为深入探讨急性病毒性坏死病毒(Acute Viral Necrosis Virus,AVNV)魁蚶株的致病机理以及IAP-86蛋白的功能,从感染AVNV的濒死魁蚶外套膜中提取总RNA,反转录获得c DNA。根据NCBI公布的AVNV全基因组序列中ORF86序列设计两对反向套式引物,通过c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得ORF86 5?端和3?端的非编码区,拼接获得全长c DNA序列。Blast序列比对显示,该基因与牡蛎疱疹病毒的同源性为100%,与栉孔扇贝AVNV的同源性为99%,并存在重叠基因。生物信息学分析预测,该蛋白不含信号肽,不存在跨膜区,最大疏水指数为1.800,最小疏水指数为–3.456。该蛋白存在8个潜在的磷酸化位点(包括5个丝氨酸、1个苏氨酸和2个酪氨酸),存在1个潜在的O-糖基化位点,不存在潜在的N-糖基化位点;其抗原表位主要集中在8-11、14-16、28-39、75-76、88-95、97-100和147-158位氨基酸。推测该株病毒可能为牡蛎疱疹病毒的变异株,并且基因重叠在该类病毒进化过程中可能扮演重要角色。 展开更多
关键词 急性病毒性坏死病毒 魁蚶 细胞凋亡抑制蛋白 c DNA末端快速扩增技术 生物信息学
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