背景:研究已证实诱导多能干细胞能够定向分化为心肌细胞,但目前很少有分化心肌细胞成熟度的研究报道。目的:探讨延长诱导分化时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞的形态、肌节长度、双核细胞含量、心脏基因表达、心脏蛋白表达和线粒体功...背景:研究已证实诱导多能干细胞能够定向分化为心肌细胞,但目前很少有分化心肌细胞成熟度的研究报道。目的:探讨延长诱导分化时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞的形态、肌节长度、双核细胞含量、心脏基因表达、心脏蛋白表达和线粒体功能的影响。方法:使用骨形态发生蛋白4、CHIR 99021和IWR1诱导多能干细胞向心肌细胞分化,分别在第20天和第40天收集分化心肌细胞;采用RT-PCR和免疫荧光检测分化心肌细胞中心脏基因和蛋白的表达水平;LAS X图像分析软件分析分化心肌细胞形态和肌节长度;MitoTracker Green FM线粒体染色检测线粒体总量,JC-1线粒体染色检测线粒体膜电位。结果与结论:与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞的细胞周长和肌节长度更长、细胞面积更大(P<0.05);多核细胞比例从第20天的16%左右大幅上升至第40天的29%左右(P<0.05);第40天的分化心肌细胞具有与原代心肌细胞更相近的基因表达水平,SERCA2A、Cx-43和α-MHC基因表达水平明显高于第20天的分化心肌细胞(P<0.05);与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞中TNNT2和α-MHC蛋白表达水平较高,线粒体分布密度更大,且功能性线粒体数量增加(P<0.05)。结果表明:延长诱导分化时间,可以通过增加肌节长度和功能性线粒体数量以及升高心脏基因和蛋白表达水平而提高分化心肌细胞的成熟度。展开更多
Congenital heart disease （CHD） is the leading cause of birth defects, and its etiology is not completely understood. Atrial septal defect （ASD） is one of the most common defects of CHD. Previous studies have demon...Congenital heart disease （CHD） is the leading cause of birth defects, and its etiology is not completely understood. Atrial septal defect （ASD） is one of the most common defects of CHD. Previous studies have demonstrated that mutations in the transcription factor T-box 20 （TBX20） contribute to congenital ASD. Whole-exome sequencing in combination with a CHD-related gene filter was used to detect a family of three generations with ASD. A novel TBX20 mutation, c.526G〉A （p.D176N）, was identified and co-segregated in all affected members in this family. This mutation was predicted to be deleterious by bioinformatics programs （SIFT, Polyphen2, and MutationTaster）. This mutation was also not presented in the current Single Nucleotide Polymorphism Database （dbSNP） or National Heart, Lung, and Blood Institute （NHLBI） Exome Sequencing Project （ESP）. In conclusion, our finding expands the spectrum of TBX20 mutations and provides additional support that TBX20 plays important roles in cardiac development. Our study also provided a new and cost-effective analysis strategy for the genetic study in small CHD pedigree.展开更多
目的研究心脏发育相关基因心肌转录因子NKX2.5和锌指转录因子GATA4在先天性心脏病(CHD)的相互作用关系。方法构建基因NKX2.5和GATA4真核表达质粒及脑钠肽启动子荧光素酶报告基因表达质粒,真核表达质粒经转染后,利用免疫共沉淀技术证明基...目的研究心脏发育相关基因心肌转录因子NKX2.5和锌指转录因子GATA4在先天性心脏病(CHD)的相互作用关系。方法构建基因NKX2.5和GATA4真核表达质粒及脑钠肽启动子荧光素酶报告基因表达质粒,真核表达质粒经转染后,利用免疫共沉淀技术证明基因NKX2.5和GATA4两者是否有相互作用,通过荧光素酶分析技术分析基因NKX2.5和GATA4对脑钠肽启动子序是否存在协同激活作用。结果 p CMV-HA-NKX2.5与Pre-immune作用后蛋白表达量0,与Anti-Myc作用后蛋白表达量为3.63±1.23,与Input作用后蛋白表达量为2.95±1.05,NKX2.5可将GATA4沉淀下来;p CMV-Myc-GATA4与Pre-immune作用后蛋白表达量0,与Anti-Myc作用后蛋白表达量为5.63±2.06,与Input作用后蛋白表达量为5.75±2.86,GATA4可将NKX2.5沉淀下来;脑钠肽(BNP)启动子荧光表达质粒与两者共转染比分别单独转染NKX2.5和GATA4对脑钠肽启动子的激活作用更强。结论 NKX2.5和GATA4之间具有相互作用,在心脏发育过程中起着重要的协同作用。展开更多
文摘背景:研究已证实诱导多能干细胞能够定向分化为心肌细胞,但目前很少有分化心肌细胞成熟度的研究报道。目的:探讨延长诱导分化时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞的形态、肌节长度、双核细胞含量、心脏基因表达、心脏蛋白表达和线粒体功能的影响。方法:使用骨形态发生蛋白4、CHIR 99021和IWR1诱导多能干细胞向心肌细胞分化,分别在第20天和第40天收集分化心肌细胞;采用RT-PCR和免疫荧光检测分化心肌细胞中心脏基因和蛋白的表达水平;LAS X图像分析软件分析分化心肌细胞形态和肌节长度;MitoTracker Green FM线粒体染色检测线粒体总量,JC-1线粒体染色检测线粒体膜电位。结果与结论:与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞的细胞周长和肌节长度更长、细胞面积更大(P<0.05);多核细胞比例从第20天的16%左右大幅上升至第40天的29%左右(P<0.05);第40天的分化心肌细胞具有与原代心肌细胞更相近的基因表达水平,SERCA2A、Cx-43和α-MHC基因表达水平明显高于第20天的分化心肌细胞(P<0.05);与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞中TNNT2和α-MHC蛋白表达水平较高,线粒体分布密度更大,且功能性线粒体数量增加(P<0.05)。结果表明:延长诱导分化时间,可以通过增加肌节长度和功能性线粒体数量以及升高心脏基因和蛋白表达水平而提高分化心肌细胞的成熟度。
基金Project supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 81370204, 81300072, and 81101475） Electronic supplementary materials： The online version of this article （htlp：//dx.doi.org/10.1631/jzus.B1400062） contains supplementary materials, which are available to authorized users
文摘Congenital heart disease （CHD） is the leading cause of birth defects, and its etiology is not completely understood. Atrial septal defect （ASD） is one of the most common defects of CHD. Previous studies have demonstrated that mutations in the transcription factor T-box 20 （TBX20） contribute to congenital ASD. Whole-exome sequencing in combination with a CHD-related gene filter was used to detect a family of three generations with ASD. A novel TBX20 mutation, c.526G〉A （p.D176N）, was identified and co-segregated in all affected members in this family. This mutation was predicted to be deleterious by bioinformatics programs （SIFT, Polyphen2, and MutationTaster）. This mutation was also not presented in the current Single Nucleotide Polymorphism Database （dbSNP） or National Heart, Lung, and Blood Institute （NHLBI） Exome Sequencing Project （ESP）. In conclusion, our finding expands the spectrum of TBX20 mutations and provides additional support that TBX20 plays important roles in cardiac development. Our study also provided a new and cost-effective analysis strategy for the genetic study in small CHD pedigree.
文摘目的研究心脏发育相关基因心肌转录因子NKX2.5和锌指转录因子GATA4在先天性心脏病(CHD)的相互作用关系。方法构建基因NKX2.5和GATA4真核表达质粒及脑钠肽启动子荧光素酶报告基因表达质粒,真核表达质粒经转染后,利用免疫共沉淀技术证明基因NKX2.5和GATA4两者是否有相互作用,通过荧光素酶分析技术分析基因NKX2.5和GATA4对脑钠肽启动子序是否存在协同激活作用。结果 p CMV-HA-NKX2.5与Pre-immune作用后蛋白表达量0,与Anti-Myc作用后蛋白表达量为3.63±1.23,与Input作用后蛋白表达量为2.95±1.05,NKX2.5可将GATA4沉淀下来;p CMV-Myc-GATA4与Pre-immune作用后蛋白表达量0,与Anti-Myc作用后蛋白表达量为5.63±2.06,与Input作用后蛋白表达量为5.75±2.86,GATA4可将NKX2.5沉淀下来;脑钠肽(BNP)启动子荧光表达质粒与两者共转染比分别单独转染NKX2.5和GATA4对脑钠肽启动子的激活作用更强。结论 NKX2.5和GATA4之间具有相互作用,在心脏发育过程中起着重要的协同作用。
