目的探究多发性骨髓瘤外泌体中微小RNA(miR)-let-7c对血管内皮细胞生物学功能的影响及机制。方法从多发性骨髓瘤初治患者的骨髓活检标本中原代培养出骨髓瘤内皮细胞,慢病毒感染后建立miR-let-7c过表达或抑制内皮细胞稳染株,使用细胞计...目的探究多发性骨髓瘤外泌体中微小RNA(miR)-let-7c对血管内皮细胞生物学功能的影响及机制。方法从多发性骨髓瘤初治患者的骨髓活检标本中原代培养出骨髓瘤内皮细胞,慢病毒感染后建立miR-let-7c过表达或抑制内皮细胞稳染株,使用细胞计数试剂盒(CCK-8)、Transwell迁移实验及小管形成实验检测感染后内皮细胞的生物学行为改变,并采用生物学信息技术预测miR-let-7c与argonaute1(AGO1)蛋白的靶向调控区,双荧光素酶报告基因实验论证两者之间的靶向调控作用。构建多发性骨髓瘤移植瘤小鼠模型,采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测各组移植瘤组织中miR-let-7c的表达水平,免疫组织化学标记内皮细胞表面CD31来计算各组肿瘤微血管密度(MVD);采用蛋白印迹法检测各组移植瘤组织中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、AGO1及血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达;采用qRT-PCR检测各组移植瘤组织中HIF-1α、AGO1及VEGF的mRNA表达。两组均数间用独立样本t检验,两组以上均数的比较用方差分析。结果用CCK-8试剂盒检测发现,接种后2 d LV3-miR-let-7c mimics组细胞增殖能力较NC组出现明显增强(t=25.185,P<0.05),而LV3-miR-let-7c inhibitor组细胞增殖能力较NC组明显减慢(t=8.708,P<0.05)。通过Transwell迁移实验证实,Mimics组细胞迁移能力较NC组明显增强(t=30.261,P<0.001),Inhibitor组则较对照组明显下降(t=9.459,P<0.01),小管形成实验结果显示,Mimics组细胞体外成管长度较NC组明显增强[(17.861±0.550)mm比(13.632±0.500)mm,t=5.685,P<0.01],而Inhibitor组体外成管长度则较NC组明显下降[(7.180±0.144)mm比(13.632±0.500)mm,t=12.514,P<0.001]。采用蛋白印迹法及qRT-PCR发现,Mimics组VEGF蛋白及mRNA相对水平较NC组明显增加(VEGF蛋白:t=12.720,P<0.001;mRNA:t=12.493,P<0.01),而AGO1蛋白及mRNA水平则较NC组降低(AGO1蛋白:t=6.544,P<0.001;mRNA:t=5.433,P<0.05),Inhibitor组中AGO1蛋白及mRNA水平明显升高展开更多
文摘目的探究多发性骨髓瘤外泌体中微小RNA(miR)-let-7c对血管内皮细胞生物学功能的影响及机制。方法从多发性骨髓瘤初治患者的骨髓活检标本中原代培养出骨髓瘤内皮细胞,慢病毒感染后建立miR-let-7c过表达或抑制内皮细胞稳染株,使用细胞计数试剂盒(CCK-8)、Transwell迁移实验及小管形成实验检测感染后内皮细胞的生物学行为改变,并采用生物学信息技术预测miR-let-7c与argonaute1(AGO1)蛋白的靶向调控区,双荧光素酶报告基因实验论证两者之间的靶向调控作用。构建多发性骨髓瘤移植瘤小鼠模型,采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测各组移植瘤组织中miR-let-7c的表达水平,免疫组织化学标记内皮细胞表面CD31来计算各组肿瘤微血管密度(MVD);采用蛋白印迹法检测各组移植瘤组织中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、AGO1及血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达;采用qRT-PCR检测各组移植瘤组织中HIF-1α、AGO1及VEGF的mRNA表达。两组均数间用独立样本t检验,两组以上均数的比较用方差分析。结果用CCK-8试剂盒检测发现,接种后2 d LV3-miR-let-7c mimics组细胞增殖能力较NC组出现明显增强(t=25.185,P<0.05),而LV3-miR-let-7c inhibitor组细胞增殖能力较NC组明显减慢(t=8.708,P<0.05)。通过Transwell迁移实验证实,Mimics组细胞迁移能力较NC组明显增强(t=30.261,P<0.001),Inhibitor组则较对照组明显下降(t=9.459,P<0.01),小管形成实验结果显示,Mimics组细胞体外成管长度较NC组明显增强[(17.861±0.550)mm比(13.632±0.500)mm,t=5.685,P<0.01],而Inhibitor组体外成管长度则较NC组明显下降[(7.180±0.144)mm比(13.632±0.500)mm,t=12.514,P<0.001]。采用蛋白印迹法及qRT-PCR发现,Mimics组VEGF蛋白及mRNA相对水平较NC组明显增加(VEGF蛋白:t=12.720,P<0.001;mRNA:t=12.493,P<0.01),而AGO1蛋白及mRNA水平则较NC组降低(AGO1蛋白:t=6.544,P<0.001;mRNA:t=5.433,P<0.05),Inhibitor组中AGO1蛋白及mRNA水平明显升高
