10-23脱氧核酶对结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶表达的影响及其抗菌作用 被引量：3

1

作者 李俊明 李娜 +4 位作者 朱道银 伊正君 刘晔华 杨春 何永林 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期531-535,共5页

目的探讨10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRZ)抑制结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase,ICL)的表达及其在抗结核分枝杆菌感染中的作用。方法根据计算机模拟的结核分枝杆菌ICL mRNA的二级结构设计合成5条ICL特异的10-23 DRZ(DZ1～... 目的探讨10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRZ)抑制结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase,ICL)的表达及其在抗结核分枝杆菌感染中的作用。方法根据计算机模拟的结核分枝杆菌ICL mRNA的二级结构设计合成5条ICL特异的10-23 DRZ(DZ1～DZ5),在无细胞反应体系中鉴定其对结核分枝杆菌ICL mRNA的切割活性后,在不同条件下用DZ4对结核分枝杆菌进行处理,于处理后不同时间检测ICL酶活性变化,间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测ICL的表达。用异烟肼单独处理及DZ4与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌感染人巨噬细胞系THP-1细胞,于感染后不同时间用Ziehl-Heelson染色法和结核分枝杆菌培养计数的方法,观察10-23DRZ对结核分枝杆菌感染巨噬细胞的影响,同时取经异烟肼单独处理及DZA与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌接种于Middle Brook 7H10(M7H10)培养基,观察10-23DRZ对在巨噬细胞外生长的结核分枝杆菌的影响。结果DZ1、DZ3、DZ4和DZ5在无细胞反应体系中可对ICL mRNA进行有效切割,且其活性具有高度特异性。5μmol／L DZ4与异烟肼联合应用时可显著抑制结核分枝杆菌ICL的表达,与单用相应浓度的异烟肼比较,处理1、2、3周后结核分枝杆菌ICL酶活性分别下降34．9％、46．6％、46．7％(异烟肼10μg／L)或21．9％、33．48、36．9％(异烟肼5μg/L)。DZ4与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌在巨噬细胞内存活的能力显著下降,在感染后4 d和7 d时,THP-1细胞内的荷菌量分别由单用相应浓度异烟肼处理对照组的126．5×104 CFU、307．5×104 CFU(异烟肼10μg／L)和133．0×104 CFU、325．4×104 CFU(异烟肼5μg／L)下降至54．6×104 CFU、114．3×104 CFU和71．7×104 CFU、174．4×104 CFU。10-23DRZ对结核分枝杆菌在M7H10培养基中生长无明显影响。结论异烟肼可有效促进10-23DRZ进入结核分枝杆菌;10-23DRZ与亚抑菌浓度的异烟肼联用可有效抑制结核分枝杆� 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 异柠檬酸裂合酶 基因表达

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结核分枝杆菌ICL mRNA特异性10-23脱氧核酶切割活性的鉴定及其切割特点 被引量：4

2

作者 李俊明 朱道银 +2 位作者 伊正君 江山 骆旭东 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期151-157,共7页

为鉴定结核分枝杆菌异柠檬酸裂合梅（ICL）特异性的10-23DRz在无细胞体系切割ICL mRNA的活性，并探讨其在不同条件下以及联合应用时对靶mRNA的切割特点，采用计算机软件模拟ICL mRNA的二级结构，据此选择适合的待切割靶点并设计针对相... 为鉴定结核分枝杆菌异柠檬酸裂合梅（ICL）特异性的10-23DRz在无细胞体系切割ICL mRNA的活性，并探讨其在不同条件下以及联合应用时对靶mRNA的切割特点，采用计算机软件模拟ICL mRNA的二级结构，据此选择适合的待切割靶点并设计针对相应靶点的特异性10—23DRz（DZ1～DZ5）．PCR法扩增获得纠基因并克隆入质粒pET32a＋．采用T7 RNA聚合酶体外转录法获取ICL全长mRNA后分别用DZ1～DZ5在无细胞体系中对ICL mRNA进行切割，切割产物经变性聚丙烯酰胺凝胺电泳后用银染法鉴定各DRzs的活性．选择切割活性最强的DZ4考察不同10—23DRz剂量、不同反应时间、不同镁离子浓度条件下及不同错配或突变10—23DRz的切割特点．联合应用DZ1、DZ4及DZ5在无细胞体系中对ICL mRNA进行切割。检测10—23DRz联合应用对切割效率的影响．结果表明，DZ1、DZ3、DZ4及DZ5可在无细胞体系中有效地切割ICL mRNA，其切割效率在30．8％～64．5％之间．对DZ4切割活性的检测发现，其对靶mRNA的切割具有剂量和时间的依赖性；在2—20μmol／L范围内，DZ4的切割活性与Mg^2＋浓度呈正相关；DZ4单侧底物结合臂上含一个不与靶mRNA配对的碱基时其切割效率大大降低，两侧底物结合臂上各含一个不配对的碱基或活性中心域第6位出现碱基突变（G—C）时，DZ4完全丧失切割活性．联合应用2种或2种以上10-23DRz可显著增强对底物RNA的切割效率．10-23DRz特异、有效地切割结核分枝杆菌ICL全长mRNA并显示一定的叠加效应，有望用于抗结核分枝杆菌潜伏感染的基因治疗． 展开更多

关键词 10—23脱氧核酶 结核分枝杆菌 异柠檬酸裂合酶

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结核分枝杆菌持留状态体内外模型的建立与检测 被引量：3

3

作者 陆宇 高孟秋 +3 位作者 赵伟杰 王彬 马丽萍 朱莉贞 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期211-215,共5页

目的建立体内外结核分枝杆菌持留状态模型,检测在不同条件和化疗阶段中结核分枝杆菌持留菌,探讨其与化学治疗的关系。方法应用低氧培养、定量逆转录聚合酶链反应测定结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(ICL)、小分子热休克蛋白(Acr)及85B蛋白的... 目的建立体内外结核分枝杆菌持留状态模型,检测在不同条件和化疗阶段中结核分枝杆菌持留菌,探讨其与化学治疗的关系。方法应用低氧培养、定量逆转录聚合酶链反应测定结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(ICL)、小分子热休克蛋白(Acr)及85B蛋白的 mRNA 表达变化的方法检测体内外模型中结核分枝杆菌持留菌。结果体外及动物模型中均存在结核分枝杆菌低氧培养阳性,体外模型中结核分枝杆菌 ICL mRNA 和 Acr 蛋白 mRNA 在低氧条件下表达逐渐增加,4 d 时显著增加,其对数值分别为(5.3±0.9)和(6.4±1.6)拷贝/ml,而85B mRNA 在有氧条件下明显增加,10 d时的对数值为(6.1±0.9)拷贝/ml,在低氧条件下无明显变化。在小鼠感染与治疗模型中,ICL mRNA在感染的2周和4周均有表达,在治疗4周后下降;ActmRNA 在感染4周及治疗4周不表达或表达很少,治疗8和10周表达量增加,10周的对数值为(6.2±1.7)拷贝/ml,治疗12周直至停药后4周仍有表达,停药4周的对数值为(3.0±1.6)拷贝/ml;而85B 蛋白 mRNA 则在治疗前高表达,对数值为(6.4±1.1)拷贝/ml,随着治疗时间延长而逐渐降低,治疗12周时测定值为阴性。结论成功建立了结核分枝杆菌持留状态的体外及动物模型,ICL mRNA、Acr 蛋白 mRNA 高表达可作为持留菌存在的标志,应用液体低氧培养并联合 mRNA 检测有可能检测到结核分枝杆菌持留菌。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 异柠檬酸裂合酶 逆转录聚合酶链反应

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分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定 被引量：2

4

作者 李俊明 朱道银 +2 位作者 伊正君 江山 骆旭东 《第四军医大学学报》 北大核心 2005年第1期9-13,共5页

目的 :构建融合表达ICL GFP的E .coli 分枝杆菌穿梭载体 ,在耻垢分枝杆菌 (MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶 (ICL)及绿色荧光蛋白 (GFP) ,为抗MTBICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础 .方法 :采... 目的 :构建融合表达ICL GFP的E .coli 分枝杆菌穿梭载体 ,在耻垢分枝杆菌 (MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶 (ICL)及绿色荧光蛋白 (GFP) ,为抗MTBICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础 .方法 :采用PCR法从MTBH37Rv基因组DNA中扩增出icl基因 ,克隆入pcDNA3.1(+) ,构建重组质粒pcD NA icl.用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因 ,克隆入pcDNA icl中icl基因片段的下游 ,构建重组质粒pCDIG .鉴定无误后 ,将icl gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15 ,构建融合表达ICL GFP的穿梭质粒pUVIG .将pUVIG电转化MS ,经潮霉素B筛选后 ,抽提质粒用PCR法鉴定 .培养MS的阳性转化子 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达 ,Western blot法检测ICL的表达并检测ICL GFP融合蛋白的ICL活性 .结果 :所克隆的icl序列出现一个碱基突变 ,为无义突变 .gfp序列完全正确 .重组质粒pUVIG能在E .coli MS间进行穿梭 ,并在MS中表达ICL GFP融合蛋白 .该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性 .结论 :成功构建能在MS中表达ICL GFP融合蛋白的E .coli 分枝杆菌穿梭质粒 . 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 异柠檬酸裂合酶 绿色荧光蛋白 融合蛋白 穿梭质粒

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科学家在美国航天飞机和苏联空间站上使蛋白结晶

5

作者 王旭宁 《生物技术通报》 CAS CSCD 1990年第8期7-8,共2页

在美国哥伦比亚号航天飞机上进行蛋白质结晶试验的首要研究者说,在重力接近于零的地球轨道上形成的蛋白质晶体比地球上形成的蛋白质晶体优越得多.与此同时,美国某家公司正在苏联空间站上试用相同设备在外层空间形成结晶蛋白.

关键词 美国航天飞机 地球轨道 异柠檬酸裂合酶 航天飞行 美国宇航局 发射失败 轨道飞行 生长基质 树枝状结晶 棱晶

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结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶对耻垢分枝杆菌胞内存活的影响及相关机制

6

作者 李俊明 万腊根 +3 位作者 朱道银 李娜 何永林 杨春 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期551-554,共4页

目的明确结核分枝杆菌（MTB）异柠檬酸裂合酶（ICL）对耻垢分枝杆菌（MS）在巨噬细胞内存活的影响，并初步探讨其可能的机制。方法构建MTB—icl基因的穿梭表达质粒pUV15-icl，电转化法导入MS中后检测MTB—ICL在MS中的表达。分别用rMS—p... 目的明确结核分枝杆菌（MTB）异柠檬酸裂合酶（ICL）对耻垢分枝杆菌（MS）在巨噬细胞内存活的影响，并初步探讨其可能的机制。方法构建MTB—icl基因的穿梭表达质粒pUV15-icl，电转化法导入MS中后检测MTB—ICL在MS中的表达。分别用rMS—pUV15-icl和rMS-pUV15感染鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞，于感染一定时间后测定细胞内存活的细菌数，评价MTB．ICL对MS在巨噬细胞内存活的影响。分别留取上述两组巨噬细胞的培养上清液，检测干扰素γ（IFN-γ）和一氧化氮（NO）的水平，同时采用原位TUNEL技术检测两组巨噬细胞的凋亡水平，探讨MTB-ICL对MS在巨噬细胞内存活影响的可能机制。结果RT—PCR、Western印迹和荧光显微镜检测结果证实MTB-ICL可在MS中有效表达。与rMS-pUV15比较，rMS—pUV15-icl在巨噬细胞内的存活率明显高（P〈0．01），感染后24h和48h，其菌落数分别为（32．78±2．90）×10^3和（23．33±2．34）×10^3，而rMS—pUV15菌落数分别为（14．67±2．45）×10^3和（2．28±0．25）×10^3。MTB-ICL对巨噬细胞产生IFN-γ和NO没有明显影响。原位凋亡检测结果显示，与rMS—pUV15感染组比较，rMS-pUV15-icl感染组巨噬细胞的凋亡水平明显下降。结论MTB-ICL可促进MS在巨噬细胞内的存活，其机制之一可能是抑制宿主巨噬细胞的凋亡。 展开更多

关键词 异柠檬酸裂合酶 分枝杆菌 结核 耻垢 巨噬细胞 凋亡

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结核分枝杆菌的aceA基因的克隆、序列测定及生物信息学分析

7

作者 郝方 张雪莲 +1 位作者 王洪海 裴秀英 《宁夏医学杂志》 CAS 2005年第5期297-299,共3页

目的　克隆编码结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶的基因aceA (1915 ,1916 ) ,对其全序列进行测定,并以生物信息学方法和软件分析其生物学特性,为进一步研究该酶的功能提供信息资料。方法　用PCR系统扩增出异柠檬酸裂合酶基因片段,将其插入载... 目的　克隆编码结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶的基因aceA (1915 ,1916 ) ,对其全序列进行测定,并以生物信息学方法和软件分析其生物学特性,为进一步研究该酶的功能提供信息资料。方法　用PCR系统扩增出异柠檬酸裂合酶基因片段,将其插入载体pET2 8a,对其全序列进行测定;利用序列对比分析、蛋白氨基酸序列分析及结构预测软件进行生物信息学分析和模拟。结果　克隆的基因序列与报道的序列完全一致,aceA与icl及其他编码异柠檬酸裂合酶基因同源性很高,具有保守氨基酸共有序列;初步模拟出了该蛋白的三级结构。结论　本研究通过对aceA基因序列和氨基酸进行生物信息学分析,获取了该酶的信息特征,并与现有的报道结果进行对比分析,为分子生物学诊断、治疗和药靶筛选提供理论依据。 展开更多

关键词 异柠檬酸裂合酶 生物信息学 结构模拟

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结核分枝杆菌持留状态体内外模型的建立与检测

8

作者 陆宇 高孟秋 +3 位作者 赵伟杰 王彬 马丽萍 朱莉贞 《结核病与胸部肿瘤》 2007年第2期89-93,共5页

目的建立体内外结核分枝杆菌持留状态模型，检测在不同条件和化疗阶段中结核分枝杆菌持留菌．探讨其与化学治疗的关系。方法应用低氧培养、定量逆转录聚合酶链反应测定结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶（ICL）、小分子热休克蛋白（Aer）及85... 目的建立体内外结核分枝杆菌持留状态模型，检测在不同条件和化疗阶段中结核分枝杆菌持留菌．探讨其与化学治疗的关系。方法应用低氧培养、定量逆转录聚合酶链反应测定结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶（ICL）、小分子热休克蛋白（Aer）及85B蛋白的mRNA表达变化的方法检测体内外模型中结核分枝杆菌持留菌。结果体外及动物模型中均存在结核分枝杆菌低氧培养阳性，体外模型中结核分枝杆菌ICLmRNA和Aer蛋白mRNA在低氧条件下表达逐渐增加，4d达高峰，其对数值分别为（5．3±0．9）和（6．4±1．6）拷贝／ml，而85B mRNA在有氧条件下明显增加，10d时的对数值为（6．1±0．9）拷贝／ml，在低氧条件下无明显变化。在小鼠感染与治疗模型中，ICLmRNA在感染的2周和4周均有表达，在治疗4周后下降；Aer mRNA在感染4周及治疗4周不表达或表达很少，治疗8周和10周表达量增加，对数值为（6．2±1．7）拷贝／ml，治疗12周直至停药后4周仍有表达，对数值为（3．0±1．6）拷贝／ml；而85B蛋白mRNA则在治疗前高表达，对数值为（6．4±1．1）拷贝／ml，随着治疗时间延长而逐渐降低，治疗12周时测定值为阴性。结论建立结核分枝杆菌持留状态的体外及动物模型，ICL mRNA、Aer蛋白mRNA高表达可作为持留菌存在的标志。应用液体低氧培养并联合mRNA检测有可能检测到结核分枝杆菌持留菌。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核/持留性 异柠檬酸裂合酶 逆转录聚合酶链反应

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乙酰化修饰调控结核杆菌异柠檬酸裂合酶的研究

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作者 李瑶瑶 毕静 +2 位作者 王艺红 秦云贺 张雪莲 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期8-13,共6页

目的:探索结核杆菌异柠檬酸裂合酶(ICL)蛋白322位点赖氨酸(Lys322)的乙酰化修饰对蛋白功能的调控作用。方法:构建结核杆菌ICL蛋白原核表达载体p ET28a-icl,并对Lys322位点进行定点突变为精氨酸(Arg,R)和谷氨酰胺(Glu,Q),体外表达纯化获... 目的:探索结核杆菌异柠檬酸裂合酶(ICL)蛋白322位点赖氨酸(Lys322)的乙酰化修饰对蛋白功能的调控作用。方法:构建结核杆菌ICL蛋白原核表达载体p ET28a-icl,并对Lys322位点进行定点突变为精氨酸(Arg,R)和谷氨酰胺(Glu,Q),体外表达纯化获得重组蛋白ICLWT、ICL322R和ICL322Q。通过Western blotting和酶活性测定来揭示Lys322位点突变前后对蛋白的乙酰化修饰水平及蛋白功能的影响。结果:Western blotting检测发现大肠杆菌表达体系获得的ICLWT、ICL322R和ICL322Q蛋白均有较高水平的蛋白赖氨酸乙酰化修饰信号,较ICLWT,ICL322R和ICL322Q突变蛋白的酶活性分别下降了大约50%和70%。结论:在大肠杆菌的表达体系中,ICL蛋白可以获得乙酰化修饰。ICL322Q突变蛋白酶活性的显著下降,揭示Lys322位点乙酰化修饰对ICL蛋白的功能存在负向调控。为未来深入探索赖氨酸乙酰化修饰对结核杆菌代谢,潜伏感染的调控作用奠定了基础。 展开更多

关键词 异柠檬酸裂合酶 乙酰化修饰 定点突变

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结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL的表达及鉴定 被引量：5

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作者 李俊明 朱道银 +2 位作者 伊正君 骆旭东 江山 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第1期37-40,共4页

目的　表达结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL ,鉴定其生物学活性并制备其多克隆抗体。方法　采用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因片段 ,将其插入原核表达质粒pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 icl。将pQE30 icl转化大肠杆... 目的　表达结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL ,鉴定其生物学活性并制备其多克隆抗体。方法　采用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因片段 ,将其插入原核表达质粒pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 icl。将pQE30 icl转化大肠杆菌 ,用IPTG诱导目的基因表达。Western blot免疫印迹法鉴定后纯化该表达产物 ,测定其酶活性并用此纯化蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果　序列分析发现PCR扩得的icl有两个核苷酸突变 ,但均为无义突变。在大肠杆菌中表达的目的产物经SDS PAGE分析约为 4 7kDa。免疫印迹分析证实目的蛋白与阳性结核病患者抗血清产生特异性反应。纯化的目的蛋白异柠檬酸裂解酶的酶活性为 16 .7u/mg。双向免疫扩散法测定目的蛋白免疫兔血清的抗体效价为 1 32。结论　研制出的结核分枝杆菌重组ICL具有异柠檬酸裂解酶活性和抗原性 ,重组ICL和抗ICL免疫血清的制备为抗结核分枝杆菌潜伏感染的研究奠定了必要的物质基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 潜伏感染 异柠檬酸裂合酶(ICL)

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海外传真

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《健康博览》 2000年第11期24-24,共1页

欧洲研究人员报告,突发事件比如亲属死亡或者父母关系恶化,都可能导致已患有呼吸障碍的儿童哮喘发作。医生已经知道慢性紧张能使儿童哮喘进一步恶化。

关键词 儿童哮喘 异柠檬酸裂合酶 人工心脏 海外传真

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