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广藿香醇合酶PcPTS互作蛋白的筛选与鉴定分析
1
作者 陈立凯 吴带娣 《广东农业科学》 CAS 2024年第5期1-15,共15页
【目的】广藿香[Pogostemon cablin(Blanco)Benth.]是临床常用的芳香化湿药,其质量指标成分广藿香醇具有良好的抗病毒、抗炎症等活性。广藿香醇合酶(Patchouli alcohol synthase,PcPTS)在广藿香醇生物合成途径中起关键作用,但其在蛋白... 【目的】广藿香[Pogostemon cablin(Blanco)Benth.]是临床常用的芳香化湿药,其质量指标成分广藿香醇具有良好的抗病毒、抗炎症等活性。广藿香醇合酶(Patchouli alcohol synthase,PcPTS)在广藿香醇生物合成途径中起关键作用,但其在蛋白互作层面调控广藿香醇合成的机制尚不清楚。旨在筛选PcPTS的互作蛋白,以揭示PcPTS在广藿香醇生物合成途径中的调控机制和功能。【方法】利用酵母双杂交技术和GST pull-down联合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术筛选可能与PcPTS互作的蛋白,利用MASCOT软件和BLAST分析注释互作蛋白,选取有文献报道参与其他蛋白互作、影响蛋白转运、修饰或降解、参与次生代谢调控的蛋白,利用酵母双杂交技术初步验证它们与PcPTS蛋白的互作关系并对互作蛋白进行生物信息学分析。【结果】通过PCR技术成功克隆了PcPTS的cDNA序列,开放阅读框(ORF)为1659 bp,编码522个氨基酸。构建了广藿香cDNA初级文库和酵母杂交文库,初级和次级文库容量分别为7.6×10^(6) CFU和8.6×10^(6) CFU,初级和次级文库的重组率均为100%,且插入片段平均长度均大于800 bp。构建的诱饵载体pGBKT7-PcPTS对酵母菌株不产生毒性,且无自激活活性。利用酵母双杂交筛选得到阳性克隆并进行测序和BLAST分析,获得17个候选蛋白。成功构建了GST-PcPTS表达载体,诱导表达纯化获得GST-PcPTS诱饵蛋白,利用诱饵蛋白从广藿香总蛋白中捕获互作蛋白,共鉴定出98个候选互作蛋白。从候选蛋白中筛选14个可能与PcPTS互作的蛋白,利用酵母双杂交进行点对点验证,结果发现PcC3H6、PcENO3、PcACR11和PcHAD与PcPTS存在相互作用。生物信息分析表明,四者分别属于CCCH锌指蛋白家族、烯醇化酶蛋白、ACR亚家族和HAD-like超家族。【结论】初步筛选验证获得与PcPTS存在相互作用的4个蛋白PcC3H6、PcENO3、PcACR11和PcHAD,有助于揭示PcPTS在广藿香醇生物合成 展开更多
关键词 药用成分 生物合成调控 植物代谢 酵母双杂交 广藿香醇合酶 互作蛋白
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广藿香PTS基因的克隆及CPEC法构建其过表达载体pRI101-PTS 被引量：4
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作者 黄伟展 胡贞贞 +3 位作者 卢昌华 张宏意 何梦玲 严寒静 《广东药科大学学报》 CAS 2019年第2期186-192,共7页
目的克隆广藿香中广藿香醇合酶(PTS)基因的cDNA序列,并构建其pRI101-PTS植物表达载体。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得PTS基因的cDNA序列,利用生物信息学软件对T-A克隆后的序列进行分析,预测其编码蛋白的理化性质、结构和功... 目的克隆广藿香中广藿香醇合酶(PTS)基因的cDNA序列,并构建其pRI101-PTS植物表达载体。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得PTS基因的cDNA序列,利用生物信息学软件对T-A克隆后的序列进行分析,预测其编码蛋白的理化性质、结构和功能。以环形聚合酶延伸克隆(CPEC)构建pRI101-PTS过表达载体。结果 PTS基因的开放阅读框全长1 659 bp,编码552个氨基酸。该蛋白分子量为64.1 ku,等电点为5.39,含有DDxxD保守序列,具有2个倍半萜合酶结构域,C末端结构域268个氨基酸残基可能涉及线性萜烯的环化,成功构建了pRI101-PTS过表达载体。结论 PTS的克隆、植物过表达载体的构建及生物信息学分析为其他倍半萜类合成酶基因的发现和研究提供了参考,也为进一步研究其生物合成调控机制甚至代谢工程奠定基础。 展开更多
关键词 广藿香 广藿香醇合酶 倍半萜合酶 环形聚合酶延伸克隆 生物信息学
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利用VIGS技术研究广藿香醇合酶基因PatPTS的功能 被引量：4
3
作者 靳巧春 于放 +1 位作者 于宗霞 冯宝民 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期39-45,共7页
广藿香精油主要存贮在植物地上组织的盾状腺毛中。提取广藿香(马来西亚品系)叶片的总RNA后,通过PCR技术扩增得到广藿香醇合酶基因(Pat PTS)的全长c DNA序列,共编码552个氨基酸,与Gen Bank中已报道的印度广藿香中广藿香醇合酶的氨基酸序... 广藿香精油主要存贮在植物地上组织的盾状腺毛中。提取广藿香(马来西亚品系)叶片的总RNA后,通过PCR技术扩增得到广藿香醇合酶基因(Pat PTS)的全长c DNA序列,共编码552个氨基酸,与Gen Bank中已报道的印度广藿香中广藿香醇合酶的氨基酸序列存在3.6%的差异。使用烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV),选取Pat PTS作为沉默目的基因,在广藿香中构建病毒诱导基因沉默(VIGS)体系,进一步利用该体系在广藿香中鉴定Pat PTS基因的功能。病毒侵染广藿香叶片后,分别选取不同的时间点,使用GS-MS与qRT-PCR检测Pat PTS催化产物和转录水平的变化,结果发现:β-广藿香烯、β-榄香烯、石竹烯、广藿香醇等倍半萜成分的含量在VIGS侵染后第2周明显下降,1周和3周效果不明显;Pat PTS转录本下降趋势与其调控的倍半萜含量变化趋势类似;表明Pat PTS基因负责了广藿香精油主要倍半萜成分的合成。说明广藿香中VIGS体系已初步建立,并在侵染植物2周后诱导基因沉默和干扰次生代谢产物合成的效果最好,为在广藿香中快速研究基因功能打下基础。 展开更多
关键词 VIGS 广藿香 广藿香醇合酶 倍半萜类化合物
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重组大肠杆菌发酵合成广藿香醇
4
作者 王禹锡 程萍 +3 位作者 李若萱 王沁 周哲敏 周丽 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2021年第23期8-15,共8页
广藿香醇是一种天然化学品,在化妆品行业有着较广泛的应用。相对于植物提取法,微生物发酵法合成广藿香醇对节约成本和保护环境有重要意义。在广藿香醇合酶PTS2上添加促溶标签,提高可溶表达,使重组菌株Escherichia coli BL21/pMev+pET28a... 广藿香醇是一种天然化学品,在化妆品行业有着较广泛的应用。相对于植物提取法,微生物发酵法合成广藿香醇对节约成本和保护环境有重要意义。在广藿香醇合酶PTS2上添加促溶标签,提高可溶表达,使重组菌株Escherichia coli BL21/pMev+pET28a-PTS2/T7A广藿香醇产量提高了39.74%。通过对PTS2进行同源比对、三维结构建模和分子表面氨基酸分析,确定了氨基酸突变位点,构建了PTS2突变体,表明E457、K28、K136和K343是影响酶活性的关键氨基酸位点。进一步,将合成法尼基焦磷酸的8个基因模块化分割,用T7启动子加强法尼基焦磷酸合成代谢途径,获得重组菌株BL21/pMev-T7M1M2+pET28a-PTS2,使广藿香醇产量提高了55.95%。最后,将最优的改造策略组合,得到重组菌株BL21/pMev-T7M1M2+pET28a-PTS2/T7A,广藿香醇产量累计提高了72.22%。该研究结果为大肠杆菌发酵合成广藿香醇等倍半萜化合物提供了借鉴。 展开更多
关键词 广藿香醇 广藿香醇合酶 融合标签 定点突变 大肠杆菌
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