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干扰素诱导跨膜蛋白1对猪源冠状病毒吸附宿主细胞的影响 被引量：4
1
作者 颜可欣 邓治邦 +3 位作者 贺佳怡 袁琦超 王教顺 袁晓民 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第4期1370-1380,共11页
为探索干扰素诱导跨膜蛋白1(interferon-inducible transmembrane protein 1,IFITM1)对猪源冠状病毒复制的影响,本研究选用猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)高致病毒株及其宿主细胞PK15作为研究对象。正常... 为探索干扰素诱导跨膜蛋白1(interferon-inducible transmembrane protein 1,IFITM1)对猪源冠状病毒复制的影响,本研究选用猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)高致病毒株及其宿主细胞PK15作为研究对象。正常PK15细胞接种TGEV后,实时荧光定量PCR检测感染后不同时间点PK15细胞中一些干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的mRNA表达水平;利用慢病毒表达系统构建稳定表达和稳定干扰IFITM1表达的PK15细胞系。将一段靶向干扰猪源IFITM1的shRNA序列及猪源IFITM1全长,分别插入pLKO.1-EGFP-Puro载体及pLVML-Myc-MCS-IRES-Puro载体中,分别构建出pLKO.1-IFITM1shRNA-EGFP-Puro及pLVML-Myc-IFITM1-IRES-Puro重组质粒。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞后获得带有目的基因的重组慢病毒,慢病毒侵染PK15细胞后用嘌呤霉素进行筛选,获得稳定表达及稳定干扰IFITM1表达的PK15细胞系,分别命名为PK15-IFITM1及PK15-IFITM1-/-,并分别用实时荧光定量PCR、间接免疫荧光试验(IFA)及Western blotting检测IFITM1干扰效率及表达情况;TGEV接种PK15-IFITM1-/-和PK15-IFITM1,实时荧光定量PCR测定细胞中TGEV的拷贝数。结果显示,PK15细胞接种TGEV后的48 h内,一些ISGs的mRNA水平均有所上升;PK15-IFITM1-/-细胞系的干扰效率为70%,PK15-IFITM1细胞系表达成功;在PK15-IFITM1-/-细胞系中,IFITM1的mRNA水平显著下调,促进了TGEV的复制。反之,在PK15-IFITM1细胞系中,TGEV的复制受到了抑制。但IFITM1的表达或缺失却不影响TGEV对PK15的吸附作用。总之,IFITM1对TGEV有显著的抗病毒作用,IFITM1不影响TGEV对PK15细胞的早期吸附,这为后续IFITM1抗冠状病毒机制的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 干扰素诱导跨膜蛋白1(ifitm1) 冠状病毒 传染性胃肠炎病毒(TGEV)
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干扰素诱导跨膜蛋白3基因敲除Caco2细胞株的构建及其对水泡性口炎病毒复制的影响
2
作者 庞照霞 郝鹏飞 +3 位作者 屈巧巧 李乐天 李昌 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期476-482,共7页
通过CRISPR/Cas9系统,旨在构建干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因敲除的人结直肠腺癌细胞Caco2,并探究IFITM3基因敲除对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响。针对人IFITM3基因靶向设计sgRNA,合成后连接至pLentiv2载体中获得重组质粒,经测序... 通过CRISPR/Cas9系统,旨在构建干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因敲除的人结直肠腺癌细胞Caco2,并探究IFITM3基因敲除对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响。针对人IFITM3基因靶向设计sgRNA,合成后连接至pLentiv2载体中获得重组质粒,经测序后将正确连接sgRNA的重组质粒及辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装并感染Caco2细胞,然后进行嘌呤霉素加压筛选,利用有限稀释法获取IFITM3基因敲除单克隆细胞。利用DNA测序和Western blot对所获得单细胞克隆进行鉴定,鉴定正确的细胞命名为Caco2-△IFITM3。用表达绿色荧光蛋白的VSV(VSV-EGFP)感染Caco2-△IFITM3细胞,通过荧光显微镜观察IFITM3敲除对VSV复制的影响。基因组DNA测序结果表明,在IFITM3基因开放阅读框产生了碱基缺失,细胞中IFITM3蛋白表达消失,但细胞活性未受明显影响。病毒感染试验可观察到Caco2-△IFITM3细胞感染比例显著高于Caco2细胞,表明敲除IFITM3使其抗病毒功能减弱。本研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了基于肠道细胞敲除IFITM3基因的Caco2单细胞克隆,验证了IFITM3敲除对细胞抗VSV感染的影响,为进一步深入研究IFITM3与肠道病毒的互作及其功能奠定基础。 展开更多
关键词 干扰素诱导跨膜蛋白3(ifitm3) CRISPR/Cas9 Caco2细胞 水泡性口炎病毒(VSV)
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番鸭IFITM3基因真核表达载体的构建和表达
3
作者 罗贵峰 陈吉龙 +3 位作者 张兰兰 陈洁滢 魏璟昀 王松 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第5期104-106,共3页
为了研究番鸭干扰素诱导跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)在抗病毒感染过程中的作用,试验采用PCR扩增、酶切、连接、转化和质粒提取等方法,将番鸭IFITM3基因构建到真核表达载体p Flag-CMV-5a上。测序正确... 为了研究番鸭干扰素诱导跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)在抗病毒感染过程中的作用,试验采用PCR扩增、酶切、连接、转化和质粒提取等方法,将番鸭IFITM3基因构建到真核表达载体p Flag-CMV-5a上。测序正确的质粒转染293T细胞,运用RT-PCR和Western-blot方法鉴定IFITM3的表达情况。结果表明:构建的p Flag-CMV-Anas-IFITM3真核表达载体在293T细胞中可以进行mRNA的正常转录和蛋白的大量表达。说明番鸭IFITM3基因成功构建到p Flag-CMV-5a真核表达载体上,可以在293T模式细胞中大量表达番鸭IFITM3蛋白,并对该蛋白的抗病毒功能和分子机制进行研究。 展开更多
关键词 干扰素诱导跨膜蛋白3(ifitm3) 真核表达载体 质粒构建 表达 RT-PCR WESTERN-BLOT
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