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工程化生长转化因子β3促进软骨前体细胞向软骨分化的实验研究 被引量：4
1
作者 郑东 杨述华 +3 位作者 冯勇 唐欣 梅荣成 徐亮 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期558-561,572,F0002,共6页
目的:构建LAP(latency associated peptide in TGF-beta,LAP)为潜伏作用,MMP(matrix metalloproteinase,MMP)酶切位点为导向作用,TGF-β3活性部分为治疗作用的具有靶向治疗功能的工程化TGF-β3蛋白,并转染软骨膜来源的软骨前体细胞(chon... 目的:构建LAP(latency associated peptide in TGF-beta,LAP)为潜伏作用,MMP(matrix metalloproteinase,MMP)酶切位点为导向作用,TGF-β3活性部分为治疗作用的具有靶向治疗功能的工程化TGF-β3蛋白,并转染软骨膜来源的软骨前体细胞(chondrogenic progenitor cells,CPCs),检验其特异性的靶向治疗作用。方法:将人工合成的编码MMP酶切位点氨基酸的正反义DNA序列经基因重组定向克隆插入真核表达载体pIRES-EGFP中,之后将大鼠的TGF-β3的LAP段和TGF-β3的活性片断(mature TGF-β3,mTGF-β3),分别插入到MMP的上游和下游,获pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3重组质粒。然后将其转染入软骨膜来源的CPCs,将转染后的CPCs在有MMP-1和无MMP-1的条件下进行球团培养,并分别检测胶原Ⅱ(COLⅡ),Aggrecan(Agc)和TIMP的表达。结果:经过测序和酶切鉴定,成功构建了pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3质粒,转染CPCs后,只有MMP酶存在的条件下才能有效的促进CPCs向软骨分化和软骨基质的合成。结论:通过基因工程构建的工程化TGF-β3具有靶向性促进软骨前体细胞修复软骨的应用前景。 展开更多
关键词 工程化蛋白 软骨前体细胞 基因克隆 生长转化因子β3 软骨分化 软骨修复
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双定位信号增强工程化蛋白线粒体靶向性呈递
2
作者 周冰倩 李尚朴 +5 位作者 王旭 孟祥宇 邓竞荣 邢金良 王建刚 徐坤 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期937-946,共10页
有效传递工程化改造的蛋白进入线粒体对开发高效的线粒体DNA编辑工具、实现线粒体疾病精准治疗具有重要意义。本研究选取eGFP和Cas9基因,在其上游或/和下游引入不同的线粒体定位信号(mitochondrial localization signal,MLS)序列,分别... 有效传递工程化改造的蛋白进入线粒体对开发高效的线粒体DNA编辑工具、实现线粒体疾病精准治疗具有重要意义。本研究选取eGFP和Cas9基因,在其上游或/和下游引入不同的线粒体定位信号(mitochondrial localization signal,MLS)序列,分别构建了相应的工程化蛋白表达载体。将不同表达载体转染HEK293T细胞后,利用荧光共定位实验和免疫印迹实验分析不同工程化蛋白的线粒体靶向性呈递效果。结果显示,相比单端添加MLS的eGFP和Cas9蛋白,双端MLS改造均显著提高了工程化蛋白的线粒体靶向性呈递效率。推测双MLS策略可增强工程化蛋白的线粒体靶向性,为以后开发高效的线粒体DNA编辑工具奠定了理论基础。 展开更多
关键词 线粒体疾病 线粒体DNA编辑 工程化蛋白 线粒体定位信号 线粒体靶向
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构建具有靶向治疗作用的工程化生长转化因子-β3蛋白的实验研究 被引量：2
3
作者 李进 杨述华 +5 位作者 郑东 杨操 冯勇 傅德皓 梅荣成 徐亮 《中华创伤骨科杂志》 CAS CSCD 2007年第9期842-846,共5页
目的构建前体相关蛋白（LAP）为潜伏作用，基质蛋白金属酶（MMP）酶切位点为导向作用，生长转化因子-β3（TGF-β3）活性部分为治疗作用的具有靶向治疗作用的工程化TGF-β3蛋白，并检验其特异性的靶向治疗作用。方法将人工合成的编码MM... 目的构建前体相关蛋白（LAP）为潜伏作用，基质蛋白金属酶（MMP）酶切位点为导向作用，生长转化因子-β3（TGF-β3）活性部分为治疗作用的具有靶向治疗作用的工程化TGF-β3蛋白，并检验其特异性的靶向治疗作用。方法将人工合成的编码MMP酶切位点氨基酸的正、反义DNA序列经基因重组定向克隆插入真核表达载体pIRES-EGFP中，获得pIRES—EGFP—MMP重组体，用PCR从大鼠胚胎组织中TGF-β3的LAP段和TGF-β3的活性部分mTGF-β3，分别插入pIRES-EGFP-MMP中MMP的上游和下游，获得pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3重组体。然后将其转染入CHO细胞，最后用Westen Blot检测不同环境下细胞上清液中TGF-β3蛋白的表达。结果经过测序和酶切鉴定，确认成功构建了pIRES—EGFP—LAP—MMP-mTGF-β3质粒，转染CHO细胞后也成功表达了工程化TGF-β3蛋白，而且这种蛋白只在有MMP存在的条件下才能特异性地释放出有活性的mTGF-β3。结论通过基因工程技术，可成功构建工程化TGF-β3蛋白真核表达载体，其蛋白产物具有特异性的靶向治疗功能。 展开更多
关键词 工程化蛋白 靶向治疗 生长转化因子-β3 真核细胞 软骨分化
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生长抑素(SS)与硫氧还原蛋白(Thioredoxin)相融合生成的2种基因工程化融合蛋白SS-N/X和SS-N/S的表达特性 被引量：1
4
作者 刘永庆 陈溥言 +1 位作者 杜念兴 赵国屏 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期172-176,共5页
对基因工程化生长抑素 (som atostatin,SS) -硫氧还原蛋白 (Thioredoxin)融合蛋白 SS- N/ X和 SS- N/ S的表达产量、水溶性、Triton X- 10 0对 SS融合蛋白水溶性的影响、包涵体的溶解和复性特点以及 SS的抗原性与免疫原性等特性进行了... 对基因工程化生长抑素 (som atostatin,SS) -硫氧还原蛋白 (Thioredoxin)融合蛋白 SS- N/ X和 SS- N/ S的表达产量、水溶性、Triton X- 10 0对 SS融合蛋白水溶性的影响、包涵体的溶解和复性特点以及 SS的抗原性与免疫原性等特性进行了研究。结果显示 ,在 30℃的低温下用 IPTG诱导表达 ,SS- N/ X融合蛋白主要以可溶性形式存在 ,占 75 .8% ,包涵体仅占 2 4 .2 % ;而 SS- N/ S融合蛋白则主要以包涵体的形式存在 ,占 81.1% ,可溶性蛋白仅占 18.9% ;32 C载体(p ET- 32 C)蛋白则居二者之间 ,可溶性蛋白与包涵体大约等比例出现。SS- N/ S在低温下诱导可超量表达 SS融合蛋白 ,其表达量约占菌体总蛋白的 4 0 .94 %。 0 .5 % Triton X- 10 0对融合蛋白的水溶性有非常显著的影响 ,几乎可使所有的 SS- N/ X融合蛋白和大部分 SS- N/ S融合蛋白及 32 C硫氧还原蛋白变成水溶性的。 32 C硫氧还原蛋白包涵体在尿素中的溶解度明显高于 SS- N/ S包涵体 ,2 mol/ L尿素可使近一半的 32 C硫氧还原蛋白包涵体溶解 ,而 SS- N/ S包涵体只有 2 7.5 %溶解 ;但在 5 mol/ L 尿素时 ,两者均可基本全部变为可溶性的。在 SS融合蛋白包涵体溶解时加入还原剂二硫苏糖醇 ,可明显降低 SS的抗原性。 SS融合蛋白 展开更多
关键词 硫氧还原蛋白 基因工程化融合蛋白 生长抑素 SS 基因工程疫苗 抗原性 免疫原性
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